罗非鱼无乳链球菌快速检测方法的建立及链球菌病的免疫防治技术研究

【摘要】罗非鱼是海南等我国南方地区重要的淡水养殖鱼类,但随着其养殖发展,病害的影响越来越严重,其中,细菌性疾病是罗非鱼养殖中最常见和危害最大的疾病,目前常见的细菌性病原包括荧光假单胞菌(Pseudcmonasfluoroscercs)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、海豚链球菌(Streptococcusiniae)和无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)。在罗非鱼疾病的防治方面,虽然抗生素类药物具有一定的效果,但存在耐药性、药物残留以及污染环境等缺陷,迫切需要探索安全高效的防治措施以促进罗非鱼养殖产业的可持续健康发展。为了快速准确检测养殖罗非鱼细菌性病原,本文采用分子生物学方法建立了上述罗非鱼无乳链球菌的PCR快速鉴定方法,并利用16SrDNA序列对分离筛选获得的无乳链球菌进行分型。为了探索罗非鱼链球菌病的安全高效控制措施,本文以海南当地分离的罗非鱼无乳链球菌强毒株制备了灭活疫苗,利用分光光度计建立了疫苗浓度的快速测定方法,比较研究了高渗浸泡等多种不同免疫接种方法及其免疫效果,建立了适合罗非鱼大批量接种的高渗浸泡免疫操作流程,具体内容和结果如下：(1)PCR快速检测无乳链球菌方法的建立。无乳链球菌的特异基因设计了引物,建立了一种快速检测上述病原菌的PCR方法,结果表明,PCR反应程序为95℃5min、94℃1min,56℃1min、72℃2min,72℃10min时能快速检测无乳链球菌,其中,无乳链球菌的检测下限为102cells/mL。利用该快速方法从广东、海南两地采集到的罗非鱼致病菌种分离出17株无乳链球菌,利用16SrRNA分子生物学对该17株细菌进一步鉴定结果与本研究建立的快速检测方法的检测结果一致,说明本文建立的快速检测方法具有较高的准确性。(2)无乳链球菌分子分型。以16SrRNA技术对广东和海南两地采集的无乳链球菌进行分析,结果显示,两地采集的无乳链球菌基因型差异不大,且均有较强的致病性,为广谱性疫苗的制备提供了良好保障。(3)无乳链球菌灭活疫苗制备及浓度测定：取-80℃保存的罗非鱼无乳链球菌强毒株经脑心浸液培养基活化、扩大培养后,以0.4%甲醛4℃灭活24h,经过安全性和有效性检测,获得了安全高效的无乳链球菌灭活疫苗。为了快速准确测定疫苗浓度,以分光光度计建立了该疫苗浓度的快速测定方法。结果表明,检测波长600nm时,无乳链球菌灭活疫苗的吸光值(X)与其浓度(Y)呈正相关(r=0.9983,df=6,P<0.01),其关系曲线为：y=11.277x-2.0229。(4)不同方法接种无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫保护效果。分别利用注射、浸泡和口服3种方法对50日龄罗非鱼接种无乳链球菌灭活疫苗,结果显示,以注射法或浸泡法对罗非鱼接种疫苗后,均可显著提高罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力,其中,以注射法对罗非鱼进行1次和2次免疫的相对保护率分别为66.67%和78.33%,以高渗浸泡法进行1次和2次免疫的相对保护率分别为21.67%和28.33%,以等渗浸泡法进行1次和2次免疫的相对保护率均为18.33%,以口服法进行1次和2次免疫的相对保护率分别为3.33%和1.67%。对接种鱼类的抗体效价和多种非特异性指标检测结果也表明,罗非鱼以注射法或浸泡法接种疫苗后,其抗体效价、血清蛋白、溶菌酶活性,及碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P<0.05),表明以注射法和浸泡法均可用于罗非鱼无乳链球菌灭活疫苗的免疫接种。(5)不同日龄罗非鱼浸泡接种无乳链球菌灭活疫苗的免疫保护效果。对10日龄、20日龄和50日龄罗非鱼分别以等渗和高渗浸泡法接种无乳链球菌灭活疫苗,结果显示：不同日龄罗非鱼经等渗和高渗浸泡法1次接种无乳链球菌灭活疫苗后,10日龄罗非鱼的相对保护率分别为0和6.67%；20日龄罗非鱼的相对保护率分别为15%和10%；50日龄罗非鱼的相对保护率分别为13.33%和15%；不同日龄罗非鱼经等渗和高渗浸泡法2次接种无乳链球菌灭活疫苗后,10日龄罗非鱼的相对保护率分别为3.33%和1.67%；20日龄罗非鱼的相对保护率分别为26.67%和38.33%；50日龄罗非鱼的相对保护率分别为16.67%和26.67%。不同高渗浸泡处理对罗非鱼生长影响实验结果表明,10日龄组罗非鱼经高渗浸泡处理后生长速度显著下降,20日龄和50日龄罗非鱼经高渗浸泡处理后,生长速度没有显著影响。综合免疫保护和生长速度影响实验,以2次高渗浸泡法接种无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼具有最佳免疫保护效果。
【作者】张晗；
【导师】周永灿；王世锋；
【作者基本信息】海南大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】罗非鱼；无乳链球菌；灭活疫苗；快速检测；高渗浸泡免疫；

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