猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用

【摘要】猪瘟(classicalswinefever,CSF)是猪的一种高度接触性烈性传染病,被认为是严重危害和制约我国养猪业发展的重要传染病。尽管我国早在1956年就研制出了世界上最有效的猪瘟兔化弱毒疫苗,成功控制了猪瘟在我国的大规模爆发,但其一直没有得到根除。近年来,猪瘟在我国的流行呈现非典型性、慢性、持续性感染和隐性感染等新特点,免疫猪群发生猪瘟的情况越来越多,这些对猪瘟的预防和控制提出了新的挑战。我国现阶段主要采用ELISA方法对免疫猪群进行抗体水平的监测,该方法需要几小时才能完成,且要求有熟练的实验操作人员和特殊的仪器,不能满足临床实践中对抗体水平监测,快速、可靠、廉价的需求。因此,建立猪瘟病毒抗体的快速检测方法具有非常重要的意义。现有研究表明,猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白能刺激动物机体产生中和抗体,是CSFV最重要的保护性抗原,可用于建立猪瘟血清学检测方法。本研究利用原核表达的猪瘟E2融合蛋白,建立了检测猪瘟病毒抗体的双抗原夹心胶体金免疫层析方法,制备了快速检测试纸条,取得了如下研究结果：根据GenBank上发表的猪瘟病毒E2蛋白的基因序列,设计引物扩增去除信号肽和跨膜区的大小约560bp的E2基因片段。将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(＋)中,成功构建高效表达载体pET-32a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析初步确定融合蛋白在上清中表达,大小约为38KDa。E2蛋白经镍柱纯化后进行Westernblotting分析,表明融合蛋白E2-pET32a具有免疫原性。用纯化的E2蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗E2蛋白多克隆抗体,抗血清经粗提和纯化,抗体蛋白的浓度为2.1mg/ml.采用柠檬酸三钠还原法,制备的胶体金颗粒的直径为20-30nm,质量良好。选用猪瘟重组E2蛋白标记胶体金作为捕捉抗原,将纯化的E2蛋白和兔抗E2多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜(NC)的检测线和质控线上,制备猪瘟抗体胶体金免疫层析检测试纸条。经试验证实,胶体金标记蛋白的最适pH值为7.5,E2蛋白最适标记量为9.6mg/ml;最佳的蛋白包被液为0.01mol/LpH7.2的PB+0.1%BSA;E2蛋白的最佳包被浓度为1.5mg/ml;兔抗E2IgG最佳包被浓度为1.0mg/ml;最佳封闭液配方为：0.5%PVP+0.75%吐温-20+0.5%PEG20000+2%BSA+0.02%NaN3+10mMpH7.2PBS.对试纸条进行了特异性检测,结果显示试纸条特异性良好,不与BVDV,PRRSV和PCV2抗体发生交叉反应。并且稀释CSFV标准抗体到1：16时仍可以检测到条带,说明试纸条灵敏度尚可。应用制备的CSFV抗体检测试纸条和IDEXX的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒,分别检测来自江苏太湖和浦口的共计80份血清样品,两种检测方法的符合率为90.3%。
【作者】尹梅；
【导师】姚火春；王永山；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪瘟病毒E2蛋白；胶体金免疫层析试纸条；猪瘟抗体检测；

【参考文献】
[1]石红.房屋管理信息系统建设总体规划的思路[J].科技情报开发与经济,2003,05:190-191.
[2]宫翊.论商业银行破产的标准[D].中国政法大学,民商法,2014,硕士.
[3]李钢.中国水生半翅目部分昆虫线粒体Cytb基因的分子进化与系统学研究[D].陕西师范大学,动物学,2004,硕士.
[4]王佩.建构主义翻译学视角下的外宣翻译[D].华中师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[5]马婷.甘肃省电力投资集团信息化管理问题和改进策略[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[6]樊伟.新型吸附材料去除水中重金属污染物研究[D].中国疾病预防控制中心,2013.
[7]李星野,王书宁,王万宾.“增强找链接”算法——一种新的非线性逼近方法(英文)[J].自动化学报,2003,01:8-13.
[8]朱凤娟,王主丁,陆俭,张巧霞,向婷婷.考虑小区发展不均衡的空间负荷预测分类分区法[J].电力系统自动化,2012,12:41-48.
[9]张学敏,张立国,钮应喜,鞠涛,李哲,范亚明,杨霏,张泽洪,张宝顺.外延生长碳化硅-石墨烯薄膜的制备及表征研究[J].功能材料,2015,04:4140-4143.
[10]胡时友.三峡链子崖危岩体锚固工程的施工技术[J].OVM通讯.1999(03)
[11]翟影,阮永丰,张灵翠,刘雅丽,邱春霞.ZnO纳米棒的电致发光研究[J].人工晶体学报,2014,05:1029-1036.
[12]刘秀梅.关于Aluthge变换的数值域与数值域的不可达点[D].陕西师范大学,基础数学,2004,硕士.
[13]赵超.我国上市公司财务重述对审计师变更影响的实证研究[D].南京农业大学,会计学,2012,硕士.
[14]胡雅琼.血府逐瘀胶囊调控EphB4/EphrinB2促血管新生的作用研究[D].福建中医药大学,中西医结合基础,2013,硕士.
[15]涂莎.“两会”政务微博研究[D].湖北工业大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[16]赵晓.苏州市高新区不透水表面雨水径流污染与控制研究[D].苏州科技学院,环境工程,2012,硕士.
[17]顾培.基于laponite-石墨烯复合膜的生物电极构筑及其传感性能研究[D].扬州大学,2013.
[18]李静,王贤保,杨佳,杨旭宇,万丽.氮掺杂石墨烯的制备及氧还原电催化性能[J].高等学校化学学报,2013,04:800-805.
[19]刘明武.云南xx建筑公司战略研究[D].云南财经大学,工商管理,2013,硕士.
[20]朱瑜.地方政府法治建设中的制度创新研究[D].安徽大学,宪法学与行政法学,2014,硕士.
[21]于文超.大学生人格特质、专业承诺和时间管理倾向关系研究[D].曲阜师范大学,应用心理学,2013,硕士.
[22]王正中.混合仿真中系统误差对于采样频率的限制[J].自动化学报,1980,02:94-102.
[23]李雪.胰腺癌MARVELD1表达及其影响细胞增殖与迁移能力的研究[D].哈尔滨工业大学,生物学,2014,硕士.
[24]袁桂敏.无线传感网认证与访问控制优先级簇模型[D].南京邮电大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[25]包力.新型柴油机微粒捕集器的实验研究[D].宁波大学,轮机工程,2013,硕士.
[26]任世光.新型滑板磨耗检测及自动降弓装置[J].铁道运营技术.2000(04)
[27]李丽萍.校本课程开发对高中英语学习促进作用的研究[D].山东师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[28]陈茜.建设合同中的“黑白合同”效力认定问题研究[D].内蒙古大学,法律,2014,硕士.
[29]张慧.多粒度软件网络的特性研究及演化分析[D].沈阳工业大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[30]周继红.逆变器无互联线并联关键技术的研究[D].兰州理工大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[31]张成成.传统作韵技法在当代筝曲中的继承发展[D].天津音乐学院,音乐表演,2013,硕士.
[32]周鹃.培养初中生英语学习兴趣的研究[D].华中师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[33]韦波.数据仓库技术在防洪决策支持系统中的应用研究[D].河海大学,2005.
[34]陈娇.鼻饲妥布霉素联合莫沙必利预防卒中相关性肺炎的临床研究[D].苏州大学,神经病学,2014,硕士.
[35]牟伟.我国煤炭市场供需分析与海运市场预测[D].大连海事大学,交通运输规划与管理,2012,硕士.
[36]黄宗英.面向物联网应用的嵌入式终端设备的开发与研究[D].华东理工大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[37]金凤官.2010年诺贝尔物理学奖相关知识探究[J].中学物理,2010,23:57-58.
[38]李要歌.持续性动词与短暂性动词的动态研究[D].长沙理工大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[39]肖贤.猪圆环病毒Ⅱ型疫苗规模化猪场应用比较研究[D].上海交通大学,兽医（专业学位）,2013,硕士.
[40]陈爽.新时期郭启宏戏曲创作研究[D].苏州大学,戏剧戏曲学,2014,硕士.
[41]李飞祥.非完整系统的有限时间镇定问题[D].郑州大学,基础数学,2013,硕士.
[42]曹献栋,夏德麟,晏蒲柳.国民经济指标的有效因素约简预测模型[J].计算机工程,2005,17:225-227.
[43]段婷婷.基于人工免疫系统的多策略入侵检测系统[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[44]王乐.北斗卫星广播星历及历书参数拟合算法研究[D].长安大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.
[45]韩兆坤.高中化学教师课堂教学效能感调查[D].河北师范大学,学科教学,2014,硕士.
[46]郝秋实.游泳馆空间与设施的可变设计研究[D].哈尔滨工业大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[47]周哲.我国普通高校武术高水平运动队评估指标体系研究[D].首都体育学院,民族传统体育学,2013,硕士.
[48]薛梅.符号学视角下的铁画艺术传承与发展研究[D].安徽工程大学,设计艺术学,2012,硕士.
[49]付光金,方吉平,王鑫,许津薇.浅谈HIS中数据的挖掘[J].医学信息,2004,11:717.
[50]郑锋,程勉,高为炳.分布时滞系统的反馈镇定[J].自动化学报,1995,03:257-265.