表达EGFP的重组产单核细胞李氏杆菌的构建及其免疫特性研究

【摘要】产单核细胞李氏杆菌(Listeriamonocytogenes,LM)为胞内寄生菌,可在宿主细胞浆中繁殖,因此,其减毒菌株可作为活疫苗载体,诱导机体产生抗原特异性的细胞免疫应答。PCR分别扩增绿色荧光蛋白EGFP基因、产单核细胞李氏杆菌hly基因启动子Phly和actA基因启动子PactA,将表达盒Phly-egfp和PactA-egfp分别克隆至单增李斯特菌复制型质粒pKSV7,得重组质粒pKSV7-Phly-egfp和pKSV7-PactA-egfp;重组质粒分别电转化缺失actA/plcB的产单核细胞李氏杆菌LM-1003感受态细胞,经抗生素抗性筛选和PCR鉴定得候选菌株Lm-PactA-EGFP(LM-1007)、Lm-Phly-EGFP(LM-1010);荧光显微镜观察证实候选菌株均表达EGFP,共聚焦显微镜观察证实候选菌株在被感染的小鼠巨噬细胞J774.A1中均表达EGFP,表明启动子Phly和PactA在体内和体外均工作。15只6-8周龄BABL/c(H-2Kd)小鼠平均分为3组,每组每只小鼠分别接种PBS、107CFULM-1011(pKSV7-Phly电转化LM-1003)、107CFULM-1010,免疫3次；最后一次免疫后第7天取小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,流式细胞仪检测空白组、LM1011组和LM1010组的CD4+T细胞和CD8+T细胞,CD8+/CD4+T细胞百分比依次为66.30±3.97%,128±0.26%和129±0.82%,(LM1011和LM1010的CD8+/CD4+T细胞百分比较空白组显著增加),说明LM1011、LM1010诱导了有效的细胞免疫反应；EGFP表位肽(HYLSTQSAL,H-2Kd)刺激脾淋巴细胞,ELISpot试剂盒检测分泌IFN-v的淋巴细胞数目,空白组、LM-1011组、LM-1010组分别为13.50±1.291SFC/4×105、18.75±3.304SFC/4×105、71.25±7.089SFC/4×105(LM1010组vsLM-1011组,P<0.01,差异极显著,LM-1010组vs空白组,P<0.01,差异极显著,LM-1011组vs空白组,P>0.05,差异不显著)；CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒分析乳酸脱氢酶LDH释放率来比较不同效靶比下各组CTL毒性情况,计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比,结果显示效靶细胞比率为50：1、10：1、1：1时,LM-1010组LDH释放率均显著高于LM-1011和空白对照组。上述结果显示表达EGFP的重组产单核细胞李氏杆菌可诱导小鼠产生针对EGFP的细胞免疫。PCR分别扩增EGFP基因和ActA30-264aa编码序列,并克隆至大肠杆菌表达质粒pET28a,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,SDS-PAGE证实诱导表达成功；Ni亲和柱纯化的EGFP和ActA30-264aa)经SDS-PAGE分析后,分别切割蛋白凝胶带,作进一步纯化并定量；ActA30-264aa(C1)、EGFP(C2)和ActA30-264aa+EGFP(T)分别免疫BABL/c小鼠,制备脾脏淋巴细胞,检测CD4+T细胞和CD8+T细胞：C1组、C2组、T组的CD8+/CD4+细胞百分比依次为43.75±6.39%,56.43±0.30%和69.12±5.64%(T组CD8+/CD4+匕C2组和C1组组都高)。EGFP表位肽(HYLSTQSAL,H-2Kd)刺激脾淋巴细胞,ELISpot试剂盒检测分泌IFN-γ的淋巴细胞数目：ActA+EGFP组,28.75±0.957SFC/4×105细胞;EGFP组,20.00±2.449SFC/4×105细胞;ActA组,11.5±1.732SFC/4×105细胞。(ActA+EGFPvsActA,P<0.01,差异极显著,ActA+EGFPvsEGFP,P<0.01,差异极显著)。淋巴细胞的体外细胞毒性,根据公式计算后ActA+EGFP组分泌的IFN-γ勺CD8+CTL数量高于EGFP组和ActA组,效靶细胞比为50：1、10：1、1：1时,ActA+EGFP组LDH释放率均显著高于ActA组和EGFP组,结果显示产单核细胞李氏杆菌ActA30-264aa可显著诱导小鼠产生针对EGFP的细胞免疫,表明蛋白ActA30-264aa结构域具有分子佐剂特性。
【作者】王娟；
【导师】姚火春；王恒安；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】产单核细胞李氏杆菌；疫苗载体；ActA蛋白；分子佐剂；

【参考文献】
[1]周竞.新型导电加热车削原理及其试验验证[D].厦门大学,航空宇航制造工程,2014,硕士.
[2]方立桥.油底壳加强筋和滚筋结构优化设计[D].北京交通大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[3]李赛,王丽萍,陈宏.弱视患者双眼阅读条件下的眼动特征[J].中国特殊教育,2013,05:62-66.
[4]李鸿源.基于超声导波的电站设备损伤检测方法研究[D].华北电力大学,热能工程,2014,博士.
[5]夏战战.基于景观生态安全格局的榆林榆溪河景观规划途径研究[D].西安建筑科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[6]常迎杰.数控滚齿机结构广义动态优化设计与研究[D].兰州理工大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[7]李阳.基于公务车辆管理终端的设计与开发[D].河南科技大学,机械电子工程,2014,硕士.
[8]邓明星.并联Delta机器人的传送带动态抓取系统设计[D].广东工业大学,智能工业机器人,2014,硕士.
[9]马玉凤.宋代平民妇女家庭生活研究[D].兰州大学,中国古代史,2013,硕士.
[10]熊翦.矩形顶管关键受力分析[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2013,硕士.
[11]赵静.高中生友谊质量与朋友间归因风格相似性的关系[D].东北师范大学,心理健康教育,2012,硕士.
[12]丁会平.移动数字图书馆内容管理系统的设计与实现[D].南京理工大学,2004.
[13]周熙.电子商务环境下的物流管理研究[D].重庆大学,2002.
[14]李林飞,王业亮,高鸿钧.铪烯:一种基于过渡金属元素的新型二维原子晶体材料[J].物理,2013,12:870-872.
[15]陈晓阳,丁献凡,马亮,张志根,李恭会.应用膀胱软镜处理腹腔镜输尿管切开取石时移位至肾的结石[J].健康研究,2014,03:299-300.
[16]郭晖.新乡市卫河滨水景观规划设计研究[D].西北农林科技大学,规划设计,2012,硕士.
[17]茅永兴,喻丹琳.X195型柴油机排气消声器的改进[J].柴油机.1991(06)
[18]孟萨出拉.多小区环境下的OFDMA资源分配与调度研究[D].内蒙古大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[19]颜善银.可溶性共聚聚酰亚胺及含吡啶环聚酰亚胺的合成与性能研究[D].湖北大学,材料学,2011,硕士.
[20]丁为.华能大厦岩土工程项目技术风险评价及控制[D].吉林大学,项目管理,2013,硕士.
[21]解娜娜.键接立方倍半硅氧烷的芴/咔唑共聚物的合成及发光性能研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[22]张红军.尾矿库坝体的稳定性评价[D].东北大学,安全工程,2011,硕士.
[23]闫俊.当代大学生道德知行统一问题研究[D].吉林财经大学,思想政治教育,2014,硕士.
[24]赵豫云.唐代文学与谶纬文化关系研究[D].陕西理工学院,中国古代文学,2014,硕士.
[25]赵方忠.中关村丰台园创新变奏[J].投资北京,2015,03:66-67.
[26]梁春慧,孙艳,万跃华.高被引论文的参考文献特征研究——以化学领域为例的实证分析[J].科技与出版,2014,07:119-122.
[27]黄杰,薛禹胜,文福拴,许剑冰,薛峰,董朝阳.电力市场仿真平台的评述[J].电力系统自动化,2011,09:6-13+35.
[28]梁秀文.史料在高中历史教学中的应用研究[D].西北师范大学,教育,2013,硕士.
[29]於建峰,吴正升.面向对象数据库技术及其在空间信息系统中的应用[J].海洋测绘,2003,02:13-16.
[30]张成平,蒋龙,张鸿儒.校企协同创新模式下以解决技术难题为导向的实习基地建设[J].教育教学论坛,2014,51:27-29.
[31]李诗燕,容中逵.中小学教师身份认同研究的回顾与展望[J].当代教育与文化,2014,04:90-96.
[32]罗茜.传播学视阈下的商业微电影研究[D].重庆工商大学,传播学,2014,硕士.
[33]吴志伟,柴天佑,付俊,闫占伟.电熔镁炉熔炼过程的智能设定值控制[J].控制与决策,2011,09:1417-1420.
[34]曾星星.非线性方程牛顿场线法[D].湖南师范大学,计算数学,2013,硕士.
[35]王军艳.基于粒子群优化算法的移动机器人路径规划的研究[D].中原工学院,控制理论与控制工程,2012,硕士.
[36]刘起,郭爱波.列车运行安全技术装备的研究[J].中国铁路.1995(09)
[37]范垂刚.热煤气在工业炉上的应用技术研究[D].大连理工大学,动力工程,2003,硕士.
[38]张定均.计算机局部网络——第一讲局部网络技术和协议(上)[J].冶金自动化,1988,01:53-56+52.
[39]高源.中等职业学校思想政治课教师亲和力研究[D].鲁东大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[40]金萌.我国基本医疗保险统筹路径探析[D].首都师范大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[41]何宏满.可展开结构关节特性分析[D].西安电子科技大学,机械电子工程,2012,硕士.
[42]肖同刚.坑式静压桩在湿陷性黄土地区多高层建筑顶升纠偏中的技术研究[D].西安建筑科技大学,岩土工程,2004,硕士.
[43]徐莹莹.人黑色素瘤抗原MAGE-A11对p53转录活性与稳定性的影响[D].河北医科大学,临床检验诊断学,2013,硕士.
[44]肖哲.沈飞物流装备公司供应商选择与评价研究[D].吉林大学,工业工程,2012,硕士.
[45]张贤龙.基于支持向量机和稀疏技术的中文垃圾邮件分类研究[D].华东交通大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[46]施中华.三维粒子电极光电催化性能的研究[D].沈阳理工大学,环境工程,2012,硕士.
[47]李洪杰.钢纤维锈蚀及钢纤维混凝土腐蚀的力学性能试验研究[D].郑州大学,结构工程,2013,硕士.
[48]张发成.单亲母亲家庭儿童成长困境的小组社会工作介入研究[D].苏州大学,社会工作（专业学位）,2013,硕士.
[49]管庆安.基于LabVIEW的供热监控系统的研究[D].东北石油大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[50]汤骏,龚水水,柯福佑,光善仪,徐洪耀.碳纤维结构表征及其电化学性能研究[J].山东化工,2014,12:52-55.