表达EGFP的重组产单核细胞李氏杆菌的构建及其免疫特性研究

表达EGFP的重组产单核细胞李氏杆菌的构建及其免疫特性研究

作者:师大云端图书馆 时间:2018-07-19 分类:硕士论文 喜欢:591
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【摘要】产单核细胞李氏杆菌(Listeriamonocytogenes,LM)为胞内寄生菌,可在宿主细胞浆中繁殖,因此,其减毒菌株可作为活疫苗载体,诱导机体产生抗原特异性的细胞免疫应答。PCR分别扩增绿色荧光蛋白EGFP基因、产单核细胞李氏杆菌hly基因启动子Phly和actA基因启动子PactA,将表达盒Phly-egfp和PactA-egfp分别克隆至单增李斯特菌复制型质粒pKSV7,得重组质粒pKSV7-Phly-egfp和pKSV7-PactA-egfp;重组质粒分别电转化缺失actA/plcB的产单核细胞李氏杆菌LM-1003感受态细胞,经抗生素抗性筛选和PCR鉴定得候选菌株Lm-PactA-EGFP(LM-1007)、Lm-Phly-EGFP(LM-1010);荧光显微镜观察证实候选菌株均表达EGFP,共聚焦显微镜观察证实候选菌株在被感染的小鼠巨噬细胞J774.A1中均表达EGFP,表明启动子Phly和PactA在体内和体外均工作。15只6-8周龄BABL/c(H-2Kd)小鼠平均分为3组,每组每只小鼠分别接种PBS、107CFULM-1011(pKSV7-Phly电转化LM-1003)、107CFULM-1010,免疫3次;最后一次免疫后第7天取小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,流式细胞仪检测空白组、LM1011组和LM1010组的CD4+T细胞和CD8+T细胞,CD8+/CD4+T细胞百分比依次为66.30±3.97%,128±0.26%和129±0.82%,(LM1011和LM1010的CD8+/CD4+T细胞百分比较空白组显著增加),说明LM1011、LM1010诱导了有效的细胞免疫反应;EGFP表位肽(HYLSTQSAL,H-2Kd)刺激脾淋巴细胞,ELISpot试剂盒检测分泌IFN-v的淋巴细胞数目,空白组、LM-1011组、LM-1010组分别为13.50±1.291SFC/4×105、18.75±3.304SFC/4×105、71.25±7.089SFC/4×105(LM1010组vsLM-1011组,P<0.01,差异极显著,LM-1010组vs空白组,P<0.01,差异极显著,LM-1011组vs空白组,P>0.05,差异不显著);CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒分析乳酸脱氢酶LDH释放率来比较不同效靶比下各组CTL毒性情况,计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比,结果显示效靶细胞比率为50:1、10:1、1:1时,LM-1010组LDH释放率均显著高于LM-1011和空白对照组。上述结果显示表达EGFP的重组产单核细胞李氏杆菌可诱导小鼠产生针对EGFP的细胞免疫。PCR分别扩增EGFP基因和ActA30-264aa编码序列,并克隆至大肠杆菌表达质粒pET28a,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,SDS-PAGE证实诱导表达成功;Ni亲和柱纯化的EGFP和ActA30-264aa)经SDS-PAGE分析后,分别切割蛋白凝胶带,作进一步纯化并定量;ActA30-264aa(C1)、EGFP(C2)和ActA30-264aa+EGFP(T)分别免疫BABL/c小鼠,制备脾脏淋巴细胞,检测CD4+T细胞和CD8+T细胞:C1组、C2组、T组的CD8+/CD4+细胞百分比依次为43.75±6.39%,56.43±0.30%和69.12±5.64%(T组CD8+/CD4+匕C2组和C1组组都高)。EGFP表位肽(HYLSTQSAL,H-2Kd)刺激脾淋巴细胞,ELISpot试剂盒检测分泌IFN-γ的淋巴细胞数目:ActA+EGFP组,28.75±0.957SFC/4×105细胞;EGFP组,20.00±2.449SFC/4×105细胞;ActA组,11.5±1.732SFC/4×105细胞。(ActA+EGFPvsActA,P<0.01,差异极显著,ActA+EGFPvsEGFP,P<0.01,差异极显著)。淋巴细胞的体外细胞毒性,根据公式计算后ActA+EGFP组分泌的IFN-γ勺CD8+CTL数量高于EGFP组和ActA组,效靶细胞比为50:1、10:1、1:1时,ActA+EGFP组LDH释放率均显著高于ActA组和EGFP组,结果显示产单核细胞李氏杆菌ActA30-264aa可显著诱导小鼠产生针对EGFP的细胞免疫,表明蛋白ActA30-264aa结构域具有分子佐剂特性。
【作者】王娟;
【导师】姚火春;王恒安;
【作者基本信息】南京农业大学,预防兽医学,2013,硕士
【关键词】产单核细胞李氏杆菌;疫苗载体;ActA蛋白;分子佐剂;

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