TOLL样受体在套细胞淋巴瘤中的表达及其作用研究

TOLL样受体在套细胞淋巴瘤中的表达及其作用研究

作者:师大云端图书馆 时间:2019-11-19 分类:参考文献 喜欢:3785
师大云端图书馆

【摘要】背景与目的:套细胞淋巴瘤(Mantlecelllymphoma,MCL)是B细胞恶性肿瘤的一种,占非霍奇金淋巴瘤的5-10%;在2008年新的WHO肿瘤分类中将套细胞淋巴瘤分到成熟的B细胞恶性肿瘤。MCL的瘤细胞起源于初级滤泡或次级滤泡的未受抗原刺激的CD5+CD23-的幼稚边缘区或外周血记忆性B细胞。目前套细胞淋巴瘤的治疗模式是以化疗为主的综合治疗,虽然各种治疗方案不同程度的改善MCL患者的完全缓解率,但是仍不能延长患者的总生存期[1],因此迫切需要新的治疗方法以提高患者的预后。TLRs(Tolllikereceptors,TLRs)是一类进化保守的胚系编码的模式识别受体,在识别病原微生物中发挥着重要的作用[2],于1988年首先在果蝇体内被发现[3],1997年在人体内发现其同系物,称为人类Toll蛋白[4],到目前为止,共发现13种。TLRs属于Ⅰ型跨膜蛋白,有富含亮氨酸的胞外区,富含半胱氨酸的跨膜区和TOLL/IL-1R同源的胞内区。TLRs在绝大多数血液系统恶性肿瘤中均有不同程度的表达,包括B系淋巴瘤细胞和骨髓瘤细胞等[5-8],并且有一定的生物学效应。本研究检测TLR在套细胞淋巴瘤中表达情况,以及TLR的配体对套细胞淋巴瘤的作用,其中TLR9的配体为CpG基序,CpG基序是一组从细菌DNA中提取的非甲基化的富含胞嘧啶鸟嘌呤的核苷酸序列,1995年由美国一位学者首先发现和应用[9]。CpG基序易降解,因此研究中应用人工合成的CpGDNA。CpGODN为人工合成的以非甲基化的CpG二核苷酸为核心的六核苷酸。大量的体外实验证明,CpGODN在抗肿瘤治疗、提高疫苗的效率、抗过敏反应等方面有着重要的作用[10],关于CpG的作用机制,早在1996年就发现CpG基序与Toll样受体(Tolllikereceptors)家族TLR9结合发挥作用,通过若干信号传递途径活化转录因子,启动相关细胞因子的基因转录[11]。相关研究表明,B型CpGODN对慢性淋巴细胞白血病患者的白血病细胞有着明显的诱导凋亡作用,其作用机制与JAK/STAT通路的激活有关[12]。基于套细胞淋巴瘤的治疗现状,TLR在血液系统恶性肿瘤的表达情况及研究现状,本文研究重点选择为检测TLR在套细胞淋巴瘤细胞系中的表达情况,以及TLR的配体对套细胞淋巴瘤细胞系的作用,为进一步探讨其机制提供线索。这也为提高套细胞淋巴瘤的治疗效果,改善疾病的生存和预后提供了新的潜在治疗靶点。方法:一、检测TLR的表达水平:1.取对数生长期的套细胞淋巴瘤细胞系提取RNA,按照试剂盒的说明进行反转录,进行PCR及实时定量PCR,检测TLR的表达情况;2.取对数生长期的套细胞淋巴瘤细胞系进行胞内染色,检测TLR9的表达;3.应用WesternBlot方法检测套细胞淋巴瘤细胞系TLR9的蛋白表达;4.利用免疫组化的技术,检测套细胞淋巴瘤患者的淋巴结标本中TLR9的表达情况,正常人的淋巴结标本做为对照。二、观察B型CpG684刺激细胞系后细胞的变化,应用吉姆萨染色的方法。三、检测B型CpG对套细胞淋巴瘤细胞系的作用:取对数生长期的细胞系进行试验,B型CpG684刺激细胞系为实验组,A型CpG2216刺激细胞系做为对照,第5天检测细胞的凋亡情况。结果:1.TLR的基因表达水平:(1)RT-PCR结果显示套细胞淋巴瘤细胞系G519及Mino上的TLR1-10有不同程度的表达,其中TLR3、5、9、10表达量较高;(2)实时定量PCR结果显示套细胞淋巴瘤细胞系G519及Mino上的TLR1-10有不同程度表达,其中TLR9的表达最高,增加倍数为1.45×104±168;2.TLR9的蛋白表达水平:(1)Westernblot结果:套细胞淋巴瘤细胞系G519及Mino有明显的TLR9的表达条带;(2)流式细胞术的检测结果:套细胞淋巴瘤细胞系G519及Mino有TLR9的表达;(3)免疫组化的结果:套细胞淋巴瘤患者的淋巴结石蜡切片检测到TLR9的表达较正常人明显增多。3.应用吉姆萨染色的方法观察细胞显示B型CpG684刺激后,套细胞淋巴瘤细胞发生变化。4.CpG684刺激后诱导套细胞淋巴瘤细胞G519及Mino发生凋亡:B型CpG684刺激套细胞淋巴瘤细胞系后,诱导细胞发生凋亡,且随着浓度的增加而增加;A型CpG2216刺激套细胞淋巴瘤细胞系后无明显改变。结论:1.TLR1-10在套细胞淋巴瘤细胞系中有不同程度的表达,其中TLR9较高表达,同时在套细胞淋巴瘤患者的淋巴结标本中得到验证;2.B型CpG684作用于套细胞淋巴瘤细胞系后引起细胞大小改变;3.B型CpG684刺激套细胞淋巴瘤细胞系后能够诱导套细胞淋巴瘤细胞系的凋亡。
【作者】刘晓会;
【导师】白元松;陈京涛;
【作者基本信息】吉林大学,内科学,2014,硕士
【关键词】套细胞淋巴瘤;TLRs;TLR9;CpG;

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