金属离子调控的蛋白质多尺度构象运动

【摘要】金属蛋白是指通过与一个或多个金属离子形成相互作用来稳定其折叠态结构以及帮助其行使功能的蛋白质。据估计,超过三分之一的蛋白质分子需要结合金属离子来正确执行它们的生物学功能,包括金属离子的存储和运输、信号转导、以及催化等。理解金属离子的结合过程以及由此导致的蛋白质功能性运动的分子机制具有基础性的重要意义。虽然越来越多的实验和理论研究工作提供了关于金属蛋白生物化学方面的丰富知识,但是决定金属蛋白受金属离子调控的多尺度构象变化的分子机制和物理原理仍然不清晰。在本论文中我们针对金属离子的结合以及与其耦合的蛋白质构象运动方面展开了深入的研究,主要包括(i)Ca2+离子诱导的钙调蛋白结构域的大尺度构象变化；(ⅱ)多结构域锌指蛋白识别RNA分子过程中的局域相互作用阻挫和结合诱导构象运动。通过以上两个方面的工作,我们给出了金属离子调控蛋白质分子大尺度构象运动的多个关键相互作用特征和一般规律。在钙调蛋白中,钙离子与具有helix-loop-helix结构的EF-hand模体上的钙离子结合位点相结合,引起钙调蛋白结构域由闭态向开态转变,从而导致在细胞信号转导过程中作为下游目标蛋白结合位点的疏水核心的暴露,实现与下游蛋白的结合和信号传递。这种由局域的钙离子结合导致远端靶蛋白结合位点的大尺度构象变化是典型的别构(allostery)过程。尽管蛋白质的别构运动对蛋白质行使其生物学功能至关重要,但相关的分子机制仍没有被很好的理解。本论文中,我们使用全原子分子动力学模拟和,netadynamics采样方法研究了钙离子的结合与钙调蛋白N-端结构域的两个EF-hands(EF1和EF2)的构象变化之间的耦合。我们发现,虽然两个EF-hands在结构上很相似,但是它们在结合钙离子之后发生的构象变化存在不对称性。EF1部分可以独立地受钙离子调控而采取不同的构象,而EF2的部分打开状态的稳定性却要求与EF1之间有别构信号的传播与联系。我们的结果表明,用来识别结合目标蛋白并触发信号转导的疏水位点的暴露过程,是通过钙离子诱导的EF-hands中螺旋的旋转运动来实现的,在这个旋转运动中,疏水核心扮演着支点的角色。在两个EF-hands中,钙离子结合到loop区域带负电残基的氧原子上这些结合步骤都伴随着钙离子的脱水过程。我们的工作还揭示了钙离子结合过程中一种水分子介导的配位机制,其中起介导作用的水分子减小了钙离子脱水过程的熵罚,从而有利于钙离子的配位结合与蛋白质的别构运动。钙调蛋白中两个EF-hands的别构转变是许多细胞过程的第一步,我们所展示的这个过程在原子尺度上的细节图像揭示了水分子、钙离子和钙调蛋白之间的多尺度复杂相互作用。TFⅢA蛋白的主要部分是由九个串连的Cys2His2型锌指结构域组成。它既可以作为转录因子结合到5SrRNA的基因上,又可以作为分子伴侣直接结合到5SrRNA转录产物上。虽然很多生化实验和结构数据为TFⅢA识别5SDNA/RNA提供了有用的信息,但是识别过程中那些对结合强度和结合特异性有贡献的构象运动以及能量因素仍然不清楚。我们利用分子动力学模拟和MM/GBSA(MolecularMechanics/GeneralizedBornSurfaceArea)计算方法研究了TFⅢA中间部分的三个锌指结构域在识别5SrRNA过程中发生的构象变化,以及影响结合强度和特异性的能量因素。我们的结果揭示了三个锌指结构域之间发生的显著的域间构象变化。这些构象变化过程涉及到多个关键的DNA/RNA结合位点的暴露/包埋,这可能和DNA,RNA对TFⅢA结合的竞争有关系。特别是,我们的分子模拟结果发现,TFⅢA的三个锌指结构域与DNA的相互作用不是全部最优化的。相反地,为了确保zf5与DNA之间的序列特异性识别,其他两个锌指与DNA的相互作用存在能量阻挫。这反映了蛋白质与DNA识别过程中结合亲和性与结合特异性之间的平衡和优化。Lin28蛋白通过其zinc-knuckle型的锌指结构域和pre-let-7miRNA的末端loop区域的直接相互作用来识别并结合pre-let-7miRNA,这将阻断生成成熟的let-7miRNA,Lin28-pre-let-7的相互作用在肿瘤生成过程中有着十分重要的地位。虽然如此,结合导致的构象变化,以及影响到序列特异性识别的关键物理相互作用仍然是不清楚的。我们使用分子动力学模拟以及MM/GBSA和能量分解方法研究了Lin28的锌指结构域在结合pre-let-7miRNA过程中发生的构象变化,以及对结合特异性有影响的残基层次上的氨基酸-核苷酸相互作用。我们发现,miRNA的结合导致了两个锌指结构域之间的构象变化,其中包括了关键的miRNA结合残基的相对位置的改变。此外,我们通过对miRNA序列引入突变来研究各个残基对Lin28-pre-let-7结合强度的影响。我们的结果揭示了Tyr140、His148和His162的侧链和G2、G5核苷酸的碱基之间的堆叠相互作用在Lin28对pre-let-7识别过程的序列特异性相互作用中的重要性。本论文的研究结果有以下突破和创新之处：ⅰ)我们完整地刻画出了nCaM中Ca2+结合与构象变化相耦合的自由能面,并给出了Ca2+结合到各个天然配体的先后顺序,以及后续的EF-hand螺旋以疏水核心为支点发生的旋转运动。ⅱ)我们通过metadynamics模拟揭示了一种水分子介导的金属离子配位机制,在这种机制中,介导水分子可以有效地降低金属离子脱水过程的熵罚,从而有助于金属离子的高效结合与蛋白质的构象变化。ⅲ)我们展示了多结构域蛋白TFⅢA在结合RNA前后的构象变化。这些构象变化包括了各个锌指结构域之间相互作用界面上一些关键的核酸结合残基的暴露、包埋过程。这一机制可能与5SrRNA表达过程的自调节机制相关。iv)在蛋白质折叠过程中存在一种残基层次上的“局域阻挫”现象。在本论文中我们展示了生物分子相互作用过程中结构域层次上的“局域阻挫”：某些结构域的序列特异性相互作用会导致其它部分的非特异性相互作用强度降低,这对于两种结合模式之间的平衡以及蛋白质获得最优结合状态有着重要的意义。本论文的内容安排如下:·第一章主要简述了本论文研究的背景和意义,以及所采用的技术手段。·在第二章中我们讨论了Ca2+结合及其诱导的钙调蛋白N-端结构域(nCaM)的构象变化,以及水分子在其中起到的重要作用。·在第三章中我们探讨了TFⅢA与5SrRNA结合过程中的构象变化,以及对结合强度和序列特异性有影响的能量因素。·在第四章中我们展示了Lin28的两个锌指结构域对pre-let-7miRNA的识别机制,以及氨基酸侧链-核酸碱基堆叠相互作用在序列特异性识别中的重要性。·在第五章中我们对全文进行了总结,并展望了相关领域的研究前景。
【作者】谭丞；
【导师】王炜；李文飞；
【作者基本信息】南京大学，物理学，2014，博士
【关键词】分子模拟；自由能面；别构；水介导的配位；锌指；构象变化；miRNA；序列特异性识别；

【参考文献】
[1]杨燕.高校内部管理沟通中的问题及对策研究[D].中南民族大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[2]徐付彪.自蔓延合成法制备石墨烯及其镍基复合材料性能研究[D].哈尔滨工业大学,2014.
[3]侯睿哲.弥散张量成像FA值和ADC值在胶质瘤分级和肿瘤浸润中应用的Meta分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[4]陈晓航.中国嘉陵技术中心创新能力研究[D].重庆大学,工商管理,2003,硕士.
[5]吴伟.磺酰化乳糖基神经酰胺影响人肝癌细胞整合素αV的分子机制研究[D].复旦大学,生物化学与分子生物学,2011,博士.
[6]谢佳.译者主体性下《庄子》核心词“道” 的英译研究[D].湖南师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[7]谢霈.用户需求导向下的视频网站发展策略研究[D].安徽大学,传播学,2014,硕士.
[8]黄明新,刘椿年.基于归纳逻辑程序设计的特异规则挖掘[J].北京工业大学学报,2003,04:495-499.
[9]陈红.汤亭亭的《女勇士》和黄哲伦的《新移民》之间的艺术共性[D].内蒙古大学,英语语言文学,2014,硕士.
[10]耿业仙.基于C/S模式的科研项目管理系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[11]孙藜玮.EGCG对小鼠H_(22)肿瘤生长及VEGF、PCNA表达的影响[D].青岛大学,营养与食品卫生学,2013,硕士.
[12]王孝娟.基于MOEMS扫描光栅微镜的微型近红外光谱仪的控制与信号获取系统[D].重庆大学,仪器仪表工程（专业学位）,2014,硕士.
[13]曾少林.基于磁性纳米组装材料分离富集环境中的6种指示性多氯联苯单体的分析方法研究[D].宁波大学,无机化学,2013,硕士.
[14]王萍.陕西省普通高校排球运动开展现状调查分析[D].延安大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[15]徐碚.基于QFD的CS实施决策研究[D].华中科技大学,2004.
[16]王俊斌.甜菜抗（耐）丛根病某些生理生化特性的研究[D].内蒙古农业大学,植物学,2004,硕士.
[17]张磊.快速城镇化背景下安徽省城乡规划管理对策研究[D].安徽大学,公共管理,2012,硕士.
[18]张美青.计算机辅助设计二酮酸类HIV-1整合酶抑制剂的研究[D].浙江大学,化学,2013,硕士.
[19]程金箴.第62届SEG年会在新奥尔良市召开[J].石油地球物理勘探,1993,01:96.
[20]王少昆.日常生活中“吹牛”现象的社会学解析[D].华中师范大学,社会学,2013,硕士.
[21]王晓磊.博士生超期毕业影响因素研究[D].哈尔滨工业大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[22]陈伟锋.小区智能家居系统的研究与实现[D].解放军信息工程大学,软件工程,2012,硕士.
[23]孔汉金.羊口疮病毒感染宿主细胞的蛋白质组变化及功能分析[D].华中农业大学,预防兽医学,2014,硕士.
[24]杜亮亮.数字焊机远程监控系统的设计与实现[D].广西科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[25]杨美娥.溢流面板堆石坝泄槽底板水平锚固体抗拔力计算[D].新疆农业大学,水工结构工程,2012,硕士.
[26]吴慧欣.三维GIS空间数据模型及可视化技术研究[D].西北工业大学,2007.
[27]徐可心.武汉市历史文化名镇（村）评价指标体系研究[D].华中科技大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[28]田茂义,卢秀山,张燕,马锦.基于Oracle的“数字城市”基础地理空间数据库的实现[J].测绘科学,2005,03:80-82+7.
[29]倪广妍.《歧路灯》引语研究[D].华中师范大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[30]郭亚.信用卡诈骗罪研究[D].中国政法大学,刑法学,2004,硕士.
[31]廖蔚,聂雪娥.YKGX-1油库微机控制管理系统[J].电讯技术.1993(01)
[32]赵永峰.安钢7号焦炉智能自适应加热控制系统[J].冶金自动化,2007,02:56-58.
[33]汪隆君,王钢,李博.基于半马尔可夫过程的继电保护可靠性建模[J].电力系统自动化,2010,18:6-10.
[34]邱宗波,刘晓,李方民,田向军,岳明.He-Ne激光处理与干旱胁迫对小麦幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响[J].植物生态学报,2008,05:1002-1006.
[35]郑红.世源公司B项目土地价值研究[D].对外经济贸易大学,2005.
[36]丛海霞.尝试教学法在体育院系排球普修课技术教学中的实验研究[D].东北师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[37]李超.借鉴传统文化普及方式推动马克思主义大众化研究[D].吉林大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[38]潘飞,李建革.试论中华文试论中华文化传统与当代当代城市文化生态建设[J].江苏社会科学,2015,01:212-217.
[39]陈杰.基于学生写作动机与情感态度的高中作文教学有效性策略[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[40]许寅,陈颖,梅生伟.风力发电机组暂态仿真模型[J].电力系统自动化,2011,09:100-107.
[41]王璨.多功能纳米探针的制备及在胃癌诊疗中的应用研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[42]赵杰梅,胡忠辉,张利军.区间时滞相关离散非线性系统的鲁棒模型预测控制[J].控制与决策,2015,01:59-64.
[43]姚俊峰.人工智能与混沌理论在铜锍吹炼炉实时仿真与优化决策中的应用研究[D].中南大学,2001.
[44]王要敏.近期国外组合机床技术发展状况(下)[J].组合机床与自动化加工技术.1987(10)
[45]吕梦远.陈根富:超导领域的执着探索者[J].科学中国人,2015,13:66-69.
[46]陈芳.文化贸易自由化和文化多样性的国际法律冲突与协调[D].天津财经大学,国际法学,2012,硕士.
[47]吕洪宾,马福晶,刘弘.现代农业信息系统研究[J].物流技术,2005,11:86-87+93.
[48]陈艳.“一号文件”与农民增收问题研究[D].首都师范大学,马克思主义中国化,2013,硕士.
[49]王岳桂.FCL与膝关节胫骨外侧平台的间距及其在TKA术中的临床意义[D].广州医科大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[50]欧阳珍.基于遗传算法的车间调度研究与应用[D].浙江大学,2004.