石骨症发病的分子机制研究

【摘要】背景:石骨症（Osteopetrosis）是一类以骨密度异常增加为主要特征的罕见骨发育障碍性疾病。该病一般临床表现为骨吸收活动障碍或减弱，钙化的软骨或其他异常骨样组织堆积，骨质脆性增加、硬化，导致骨髓腔变窄甚至消失而出现贫血等症状。自从1904年国外首次报道该病以来，人们研究发现该病的发生和发展与破骨细胞发育及功能障碍存在着密切的关系。多年来，石骨症致病基因诊断以及治疗是该病研究的重点。迄今为止，人们发现了数十个石骨症相关基因，但尚缺乏行之有效的治疗方法。临床上，由于石骨症致病基因较多且基因序列较长，给石骨症基因诊断带来了较大困难。一些研究结果表明全外显子组测序技术只针对外显子区域DNA进行分析，具有经济和高效等优点，可能是石骨症基因诊断的新途径。基因表达不仅仅从基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等单向流动，而是相互联系形成一个复杂调控网络。因此，深入理解和应用中心法则，在基因组、转录组和蛋白质组等水平上进行多角度贯穿性研究，有可能加深传统遗传性疾病发病机制的理解，并为新药物研发提供新信息。最近，研究表明某些特定microRNA可以控制疾病转归，提示microRNA可能作为“新药”用于人类疾病治疗。然而，在利用microRNA治疗人类疾病之前，非常有必要对特定遗传背景的疾病状态下各种组织、细胞中差异表达microRNA及其靶基因进行深入了解。因此，本课题首先采用全外显子组测序技术分析石骨症家系患者的致病基因，然后采用microRNA测序技术和iTRAQ蛋白质组学技术描绘石骨症患者外周血单个细胞（PBMCs）差异microRNA表达谱以及蛋白质组表达谱，最后综合利用这两种表达谱数据以及microRNA靶基因预测软件分析结果，在基因和microRNA的角度为石骨症的发病机制和治疗提供新信息。目的:从基因组学的角度，筛选和鉴定石骨症家系患者致病基因突变位点；从microRNA、蛋白质组学和生物信息学的角度，寻找可能与石骨症相关的microRNA及其靶基因信息，为石骨症产前基因诊断以及治疗提供依据。方法:1.石骨症致病基因定位及突变鉴定对一个现存17个家系成员的石骨症家系进行家系调查，采用DNA捕获技术捕捉2例石骨症家系患者的全基因组外显子DNA，富集后进行高通量测序，利用生物信息学技术对测序数据信息进行分析，如SNP、InDel检测、注释、统计和过滤等，得到候选石骨症致病突变位点信息。采用PCR和Sanger测序技术验证全外显子组测序分析获得的候选石骨症致病突变位点在石骨症家系成员以及我国人群中的分布情况。2.石骨症相关microRNA及其靶基因分析提取6例携带CLCN7(Y99C)突变的石骨症患者和9例对照人群受试者全血标本中的PBMCs，并把每个标本分成两份，一份用于差异microRNA表达谱分析，另一份用于差异蛋白质组学分析。microRNA测序：利用PBMCs提取的总RNA构建石骨症组和对照组cDNA测序文库，并进行高通量测序，分析测序文库中microRNA的表达情况；iTRAQ蛋白质组学分析：提取PBMCs总蛋白，利用iTRAQ试剂对肽段标记后进行液相色谱-串联质谱分析。然后采用整合多个靶标预测软件的StarBase分析差异表达microRNA的靶基因，并与差异表达蛋白对应的基因取交集，获得可能存在相互作用的候选microRNA/蛋白对。最后应用RT-qPCR、Westernblot以及双荧光素酶报告基因技术验证microRNA/靶蛋白对的表达水平以及相互作用关系。结果:1.石骨症致病基因定位及突变鉴定(1)利用外显子捕获技术成功捕获了两例石骨症患者的全基因组外显子DNA，高通量测序的平均深度分别是83×和81×，对两例患者基因组中均存在的基因变异进行过滤分析发现国外已经报道CLCN7(Y99C)是该石骨症家系的候选致病突变。(2)Sanger测序验证发现CLCN7(Y99C)存在于6例家系患者基因组内，但不存在于其他家系成员和100例对照人群基因组内。(3)结合石骨症家系临床资料和Sanger测序结果分析发现携带CLCN7(Y99C)突变的家系患者临床病征与国内、外已报道的CLCN7所致显性遗传石骨症一致。2.石骨症相关microRNA及其靶基因分析(1)microRNA测序共发现石骨症组和对照组显著差异表达的已知microRNA共123个，其中上调表达microRNA63个，下调表达microRNA60个；石骨症患者特有的新microRNA38个。(2)iTRAQ蛋白质组学分析发现显著差异表达蛋白173个，其中显著上调表达蛋白78个，显著下调表达蛋白95个。(3)关联差异表达microRNA、蛋白质以及StarBase预测得到的microRNA靶基因信息分析发现117对互为逆向表达且可能存在相互作用的microRNA/靶蛋白，其中Hsa-miR-320a和Arf1的表达水平以及它们之间的相互作用分别得到了RT-qPCR、Westernblot以及双荧光素酶报告基因技术的验证。结论:CLCN7(Y99C)是中国显性遗传石骨症家系患者的致病基因突变位点，全外显子测序技术是高效的石骨症致病基因筛查新方法。石骨症患者PBMCs中存在大量显著差异表达的microRNA和蛋白质，microRNA通过调控其靶基因表达可能在石骨症病理过程发挥着重要的作用。
【作者】欧明林；
【导师】丁敏；
【作者基本信息】重庆医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】石骨症；基因诊断；microRNA；靶基因；

【参考文献】
[1]王红健.构建我国海外投资保险制度的思考[D].山东大学,民商法学,2013,硕士.
[2]李燮.分布式目标参数估计[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2003,硕士.
[3]朱璐.中国制造业国际分工地位及其影响因素的实证研究[D].浙江理工大学,产业经济学,2014,硕士.
[4]李雅婷.流动儿童教育需求影响因素问题研究[D].华中师范大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[5]樊娟.冲突·交流[D].西北大学,2004.
[6]杨思.风电并网的电压支撑规律研究[D].山东大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[7]吕锡香.基于网络探测的IP网络安全性分析的研究[D].西安电子科技大学,密码学,2004,硕士.
[8]王科平.高效率射频功率放大器的研究[D].浙江大学,2006.
[9]谢尧.制造业中CRM的阶段实施和数据挖掘[J].计算机系统应用,2005,10:58-61.
[10]陈娜.湖北荆楚网发展战略研究[D].湖北大学,新闻学,2011,硕士.
[11]陈佳莉.个人/集体主义对知识分享的影响研究[D].西南交通大学,工业工程,2014,硕士.
[12]刘传江.基于不等分剪切区的Merchant切削模型的研究与应用[D].华中科技大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[13]杜建.基于硫化锌及其复合纳米材料的生物电化学传感器研究[D].苏州大学,分析化学,2012,硕士.
[14]戴金.单家庭亲儿童情绪管理的社会工作介入[D].苏州大学,社会工作（专业学位）,2014,硕士.
[15]何银环.应用于多视点视频编码的码率控制算法研究[D].南京邮电大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[16]崔堃鹏,夏禾,夏超逸,张楠,杜宪亭.横向撞击力对铁路桥梁及行车影响的模型实验研究[J].振动与冲击,2014,09:48-54.
[17]孟钰宝.教师专业化政策的研究[D].河北师范大学,成人教育学,2012,硕士.
[18]王克照.寻找电子政务的出路[J].软件世界.2004(04)
[19]薛冬燕.县级市行政服务中心优化服务问题研究[D].苏州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[20]桂居铎.电增强石墨烯对溶液中亚甲基蓝的吸附性能研究[D].辽宁大学,2014.
[21]张天序,翁文杰,冯军.三维运动目标的多尺度智能递推识别新方法[J].自动化学报,2006,05:641-656+658+657.
[22]朱帅帅.高中思想政治课研究性教学探索[D].山东师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[23]李月祥.高墩简支梁桥的车桥横向振动特性及横向振幅计算研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[24]祝铃钰,许轶,姚克俭.化工设计课程群的项目式教学改革探讨[J].化工高等教育,2012,02:37-40.
[25]李守川.直肠癌低位前切除术后患者排便情况相关因素分析[D].青岛大学,外科学,2013,硕士.
[26]宋玉长刘珍.银行业管理变革大趋势[N].计算机世界,2001-05-28C03.
[27]李成飞.论当代油画创作中的意象思维[D].吉林大学,美术学,2013,硕士.
[28]沙文韬.虚假陈述侵权：英美法制度规则及其我国立法构想[D].华东政法学院,法律,2004,硕士.
[29]梁春利.内置障碍物受限空间内可燃气体爆炸数值模拟[D].大连理工大学,2005.
[30]谢建春,孙宝国,梁梦兰,彭秋菊.固相微萃取／气-质联机分析牛脂控制氧化挥发性成分[J].食品与发酵工业.2005(11)
[31]占胜.远洲旅业集团酒店营销策略研究[D].西安工业大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[32]陶华东.轴入式旋风管两相流特性研究[D].浙江工业大学,2012.
[33]金钢燮,胡祥云,超敬来,南明根,康正男,金敬七,刘慧.复杂形体重磁异常的等参数有限元积分算法研究[J].石油地球物理勘探,2009,02:231-239+129+255.
[34]王蓉.文明城市创建过程中的政府行政职能研究[D].湖南师范大学,行政管理,2014,硕士.
[35]李梦露.新疆南疆人力资本投资与反贫困开发研究[D].塔里木大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[36]张建桥.建鲤、黄河鲤及黑龙江野鲤双列杂交F1生长性状及微卫星分析[D].南京农业大学,水产养殖,2011,硕士.
[37]张先成.港口铁路企业创新研究[D].广西师范大学,工商管理,2013,硕士.
[38]王治祥.关于水利建设经济预测方法的探讨[J].陕西水利水电技术.1997(02)
[39]周姗.对外汉语口语课生词教学研究[D].安徽大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[40]吴太胜.高中生思想政治课学习动力系统的校域研究与开发[D].华东师范大学,教育,2001,硕士.
[41]张宏宇.呼和浩特市房地产业发展现状及对策研究[D].内蒙古大学,高级管理人员工商管理,2013,硕士.
[42]段静.政府利用微博获取信息存在的问题及对策研究[D].福建师范大学,行政管理,2012,硕士.
[43]许静.多元化公司审计师选择动因及后果的实证分析[D].江西财经大学,会计学,2013,硕士.
[44]芦文文.大跨度管桁架屋盖体系施工过程模拟分析[D].内蒙古科技大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[45]魏伟.原位颗粒Al_4C_3对铸态AZ91D镁合金组织和性能的影响[D].太原科技大学,材料加工工程,2013,硕士.
[46]张玲娟.论新闻侵权抗辩事由的完善[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[47]田乃鲁.基于变换域的音频水印算法研究[D].南京理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[48]李安音.初中音乐课体验式教学模式的探究[D].河北师范大学,学科教育,2014,硕士.
[49]黄涛.基于ADSP-BF537的多路数字音频监控系统实现[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2011,硕士.
[50]赵倩旬.论合同中的情势变更原则[D].河北经贸大学,法律,2012,硕士.