人胚胎卵巢miRNA表达谱及miR-376a调控原始卵泡形成的研究

【摘要】哺乳动物中,卵巢原始卵泡库的大小决定了雌性在整个生育周期中用于生殖的卵母细胞数。因此,原始卵泡库的形成对于雌性哺乳动物的生殖至关重要。在人类,这一过程的失调会导致多种生殖疾病,如原发性卵巢功能不全和不孕。越来越多的研究表明,原始卵泡形成受到了严格的转录和转录后水平的调控。作为广泛被研究的转录后调控因子,microRNA(miRNA)在不同的细胞生物学过程(包括生殖)中都发挥着重要作用。miRNA成熟过程所必需的核酸内切酶Ⅲ——Dicer的缺失,会导致雌性小鼠卵泡异常和不育。但是,在原始卵泡形成过程中,miRNA的生物学功能仍然知之甚少。组织特异性miRNA表达谱的建立,是我们研究已知和新的miRNA生物学功能的重要步骤。因此,我们利用Solexa深度测序技术,建立了正常人19～21周(原始卵泡形成活跃期)胚胎卵巢的miRNA表达谱,其中包括733条已知miRNAs和5条新miRNAs。在所有匹配到基因组的小RNA中,大部分的小RNA长度介于19-23nt,其中,22nt长的小RNA所占比例最高,占所有小RNA的26.23%。我们对其中9条已知miRNAs的表达进行了荧光定量PCR实验验证,其结果与测序数据一致。通过对高丰度的和新的miRNAs预测的靶基因进行GO分析和KEGG信号通路富集分析,发现这些靶基因,参与了细胞粘附分子(Celladhesionmolecules,CAMs)介导的信号通路、mTOR信号通路、神经营养因子信号通路和Notch信号通路等,而这些信号通路已经被证明在原始卵泡发生过程中具有重要作用。这些发现为阐明miRNAs在卵泡发生中可能的调控作用,提供了基础。通过对正常人胚胎卵巢的miRNA表达谱研究,发现miR-376a可能调节增殖细胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen,Pcna)。之前的研究显示,Pcna通过调节卵母细胞凋亡进而影响小鼠原始卵泡形成,因此,对miR-376a和Pcna的调控进行了实验验证。荧光定量PCR检测发现miR-376a和PcnamRNA在原始卵泡形成前后,表达水平呈负相关。双荧光素酶报告系统实验证明了miR-376a可以直接结合在PcnamRNA的3’非编码区(3’UntransltedRegion,3’UTR)。在培养的18.5dpc小鼠卵巢中,转染miR-376amimics可以抑制PcnamRNA和蛋白的表达,卵母细胞凋亡受到抑制,存活的卵母细胞数目增多,进而促进了原始卵泡的形成。这也是第一对被证明在原始卵泡形成过程中具有调控功能的miRNA-靶基因对(miRNA-targetmRNApairs)。
【作者】张欢；
【导师】史庆华；
【作者基本信息】中国科学技术大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】原始卵泡形成；miRNA表达谱；miR-376a；Pcna；凋亡；

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