基于液质联用技术的当药多组分分析与药代动力学研究

【摘要】中国传统医学（中医）已用于临床实践了几千年。在中医治疗体系中，中药对疾病的预防和治疗起着不可或缺的作用，尤其是复杂和慢性病的治疗。Swertiapseudochinensis（在中国称为当药），中药的重要成员，是獐牙菜SwertiapseudochinensisHara的干燥全草，并已被列入中国人民共和国2010年的药典。当药属龙胆科獐牙菜属药材，在中国现已被用于治疗消化功能减退，急性和慢性痢疾，肝炎。现已发现的当药具有众多的药理作用，已被发现的有健胃，利胆，保肝，解热作用。在国内当药主要用于当飞利肝宁胶囊的生产制备。当药中的主要活性成分包含的裂环环烯醚萜苷类，黄酮类和氧杂蒽酮类等。本实验中对獐牙菜苦苷、当药苷、龙胆苦苷、芒果苷、异荭草素和异牡荆苷同时测定。建立并验证了一种快速准确的LC-MS/MS方法同时测定该6种分析物。对中药采用HPLC-MS-MS并结合化学计量技术对生物活性成分同时定量是一种可靠的方法，对当药的全面控制质量具有重要作用。为阐明天然产物和中药（TCM）的活性成分的体内作用机制，药代动力学研究是必不可少的。由于中药的疗效是基于多种成分间复杂的相互作用，当药提取物给药后多组分的药代动力学研究的研究是必不可少的。本实验开发和验证了一种新的大鼠血浆中同时分析獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素和异牡荆苷的LC-MS/MS方法。该分析方法已成功应用于口服当药提取物后多个活性成分的药代动力学研究。当药苷（C16H22O9，分子量358.344），环烯醚萜苷，广泛存在于獐牙菜属植物中并表现出多种的药理学和生物学活性。现代药理表明当药苷具有许多的药理学和生物活性，其中包括保肝作用，抗增殖，血管舒张，抗肝损伤，抗炎和抗过敏等作用。在本项研究中，开发了一种高性能的液相色谱-串联质谱法与电喷雾电离（HPLC-ESI-MS/MS）方法并成功地应用于当药苷的大鼠生物样品如血浆，组织，胆汁，尿液和粪便中的定量。本实验研究了在健康SD大鼠中当药苷的药代动力学，组织分布和排泄研究，并进行了单次口服（三个剂量）给药和静脉给药当药苷后的药动学研究。当药苷的大鼠体内药代动力学、分布和排泄方面的研究将为合适的剂型设计和临床的合理用药提供有用的信息。第一部分液质联用法同时测定当药中6种成分的含量目的：建立一种高灵敏度的高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS），对当药中的环烯醚萜类和黄酮苷进行体外定量，被测成分为獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素和异牡荆苷。方法：色谱柱：DiamonsilC18（迪马公司，150mm×4.6mm，5μm），柱温度保持在30℃，进样量为20μL。流动相：A（甲醇）和B（0.1％甲酸，V/V），使用梯度洗脱如下：0-4.5min，45%A～70%A；4.5-4.6min，70%A～95%A；4.6-10.0min，95%A；再快速返回初始比例A-B（45:55，V/V）。后运行时间6min。液相流量设定为0.8mL/min。总运行时间为10.0min。采用正负离子同时监测的多反应监测（MRM）模式对样品进行定量分析。离子喷雾电压为5500和-4500V，源温度（TEM）650℃;雾化气（GS1,N2）60psi，辅助气（GS2,N2）65psi，气帘气（N2）25psi。结果：该方法具有较高的敏感度和特异性，成功应用于同时测定当药中的活性成分。6种被测成分的峰面积和浓度在测定浓度范围内均具有良好的线性关系，检测限、定量限、精密度和稳定性均符合要求。标准曲线的相关系数均高于0.995。日内和日间的精密度（RSD）分别小于2.39%和3.47%。平均回收率在96.5%-105.1%之间。被分析成分48h内稳定性良好。该方法已成功地应用于不同产地来源的30批次的当药样品中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素和异牡荆苷的定性和定量分析。该结果表明，环烯醚萜类成分是当药中的主要活性成分（尤其是獐牙菜苦苷和当药苷）结论：实验结果表明，LC-ESI-MS/MS方法适用于当药体外定量的常规分析，对当药的质量控制提供了全面可靠的方法。第二部分液质联用法同时测定大鼠血浆中3种环烯醚萜类及3种黄酮类成分及其药代动力学研究目的：建立和验证一种LC-MS/MS方法在大鼠体内同时测定獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素和异牡荆苷，并成功应用于口服给药当药提取物后大鼠药代动力学研究。方法：采用反相DiamonsilC18柱（150×4.6mm，5μm），柱温为30℃。洗脱剂A（甲醇）和B（0.1％甲酸水;V/V）的线性梯度洗脱。使用以下梯度条件：初始0-4.5min，45%A～70%A;4.5-4.6min，70%A～95%A；4.6-10min，等度洗脱95％A。ESI源操作条件如下：离子喷雾电压为5500和-4500伏，源温度（TEM）650℃，雾化气（GAS1）和加热气（GAS2）分别设定为60和65psi。帘气保持在25psi，接口加热。全程通入氮气。当药（100克）的干燥粉末70％乙醇回流提取三次（1:20，1:20，1:10w/v），每次60min。口服给药当药提取物（4mL/kg）后大鼠眼内眦取血约0.3mL，血液样品被收集在含有肝素的离心管中。血样采集时间为0（给药前），5，10，25，40，60，75，105，150，240和360min。将血液样品以4000rpm离心10分钟，取上清50μL转移到清洁的离心管中，于-20℃保存。血浆样品处理采用液液萃取方法（LLE），样品处理后通过HPLC/MS方法对环烯醚萜类成分、黄酮类成分及IS进行分析。结果：线性参数和6种的被分析物的LLOQ表明，各化合物在试验范围浓度内线性关系良好。所有标准曲线的相关系数均高于0.99。对QC样品在三个浓度下进行测定，日内和日间精密度和准确度良好。各成分提取回收率介于76.2％和102.5％之间，基质效应介于86.2％和102.6％之间。被分析物稳定性良好。在大鼠血浆药代动力学研究中，被测组分被分成两组：环烯醚萜苷和黄酮苷类。应用非房室模型来计算的该实验的药代动力学参数。在环烯醚萜类物质中，当药苷在10min即达到最高血药浓度，而獐牙菜苦苷和龙胆苦苷则在40min。在黄酮类物质中，芒果苷、异荭草苷和异牡荆苷的达峰时间均为25min。獐牙菜苦苷、当药苷、龙胆苦苷、芒果苷、异荭草素和异牡荆苷的AUC0→t分别为94640.7、38828.4、82181.3、13425.6、3296.31和811.318ngmin/mL。无论是当药药材中的含量或大鼠血浆中的AUC的对比均发现环烯醚萜类成分远高于黄酮苷类成分。这表明，当药中黄酮苷类的生物利用度明显低于环烯醚萜类成分。总的来看，当药中6中被测活性成分在大鼠体内迅速吸收，在5min处均可检测到，随后快速吸收达到最大浓度，最终在口服给药360min后血药浓度降低至定量限附近。结论：本实验首次建立了一种新型LC-MS/MS方法对大鼠血浆中的獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素和异牡荆苷同时定量研究。本实验通过简洁的方法对样品进行处理并在较短时间内完成分析。该分析方法已成功应用于口服给药当药苷提取物后被分析物的药代动力学研究。其结果对当药作用机理的进一步研究有所帮助，并可为该中药的临床应用提供有效参考。第三部分液质联用法测定大鼠血浆中当药苷单体的含量及药代动力学特征、组织分布和排泄研究目的：开发和验证一种HPLC-MS方法分析大鼠血浆、组织、胆汁、尿液和粪便中的当药苷。方法：色谱分离采用DiamonsilC18柱（迪马公司，150mm×4.6mm，5μm）进行。该柱温度保持在30℃，进样量为20μL。流速设定为0.8mL/min。为了减少污染流入离子源，排出前2min的洗脱液。使用ESI源，使用以下条件在正离子模式下运行：电压为5500V，源温度（TEM）650℃，雾化气（GAS1）和加热气（GAS2）分别设定为60和65psi。帘气为25psi，接口加热。CXP和EP被设定为5.0V和10.0V。多反应监测（MRM）模式下进行测定。当药苷和獐牙菜苦苷（IS）使用的离子对分别为m/z359.1-m/z197.2和m/z397.4-m/z165.3。离子对的滞留时间（dwelltime）设定为200ms。在当药苷的药动学研究中，大鼠在三种剂量（5，10，15mg/kg）下进行口服给药以及1mg/kg单一剂量下进行静脉注射给药，将SD大鼠随机分为4组（每组6只）用于口服及静脉注射给药。口服给药后分别在5，15，30，45，60，90，120，180，270，360，540，720min时间点处眼内眦取血，静脉注射给药后则在5，10，20，30，45，60，75，90，120，150min时间点处取血。将血液样品立即转移到肝素化管中，并以4000rpm离心5分钟。将上层血浆转移到清洁的离心管中，于-20℃保存。在当药苷组织分布的研究中，大鼠随机分为4组（n=5）。口服给药当药苷单体10mg/kg后，分别在30，60，120min和6h时间点处收集心脏，肝，肺，脾，肾和脑样品。在胆汁排泄研究中，口服给药当药苷单体10mg/kg后，分别在0-0.5,0.5-1，1-2，2-3，3-4，4-5，5-6，6-8，8-12和12-24h时间段收集胆汁，量取胆汁体积，并保存于-20℃。在尿液和粪便排泄研究中，尿液和粪便分别在0-2，2-6，6-12，12-24，24-36和36-48h时间段收集。在本研究中，采用常规蛋白沉淀法用于各生物样品（血浆、组织匀浆、尿液、粪便和胆汁）中当药苷和IS的提取。结果：各标准曲线的相关系数均大于0.992。日内和日间精密度值（RSD，％）均小于11.2％，准确度（RE，％）介于-10.56和13.47％之间。当药苷在各基质中的提取回收率在76.12-89.21％之间。不同基质中当药苷的基质效应均在80%-120%之间。稳定性结果表明，该当药苷定量方法在大鼠各基质中稳定性良好。本实验中HPLC-MS方法已成功应用于当药苷单剂量口服给药（5,10,15mg/kg）和静脉注射给药（1mg/kg）的药代动力学研究中。应用非房室模型进行药动学参数计算。由口服给药和静脉注射给药AUC对比得出当药苷的绝对生物利用度（F%）为11.9±1.33％。药代动力学研究表明，当药苷能在大鼠体内快速达到Cmax，随后快速消除，这暗示当药苷在体内的药理作用起效较快，作用时间较短。当药苷三种口服剂量（5，10,15mg/kg）下的AUC0-∞分别为39673.2ngmin/mL，71983.6ngmin/mL和113578ngmin/mL。说明当药苷口服剂量和大鼠体内吸收成线性关系。因此，本研究结果表明，当药苷在所研究剂量范围内呈线性的药代动力学特征。在组织分布研究中发现，当药苷可快速广泛的分布至各个组织。结果表明，当药苷主要分布器官为肾，肝，脾，肺，此外还有少量的药物可以渗透到心脏和脑组织。由此看出当药苷主要分布于供血丰富组织，这意味着器官的血流量或灌注率是影响当药苷分布的关键因素。而在大脑中的可检测的少量的当药苷表明其能穿越血-脑屏障（BBB）。当药苷在胆汁、尿液和粪便中的排泄数据显示仅有2.678％（胆汁0.674％，尿液1.546％，粪便0.458％）的当药苷以原型排出。由于具有良好的水溶性，当药苷可以快速通过肾小管排泄，因此主要的排泄途径为尿液。当药苷在胆汁中的低排泄率说明只有少量当药苷原型药物由胆汁排泄，这可能是由于肝脏首过效应或其他代谢过程所导致的。以上结果表明，当药苷主要通过转化成其他代谢产物进行排泄。结论：本实验首次对大鼠口服及静脉给药当药苷后的药代动力学，组织分布和排泄进行研究。建立了一种快速、可靠、灵敏的HPLC-MS方法对大鼠生物样品如血浆、尿液、胆汁、粪便和组织中的当药苷进行定量分析。为当药苷的体内研究提供有效的信息，为其临床的合理应用提供了依据。
【作者】生宁；
【导师】王鑫国；张兰桐；
【作者基本信息】河北医科大学，中药学，2014，硕士
【关键词】当药；环烯醚萜苷类化合物；黄酮苷类化合物；LC-MS；含量测定；药代动力学；组织分布；排泄；

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