牛虻和家蝇螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索

【摘要】螺原体(spiroplasma)是一类无细胞壁、形态呈螺旋状的原核生物,以昆虫和植物为主要宿主,大多数与宿主互生,少数对动植物具有致病性。国外研究人员从虻蝇类昆虫体内分离到大量的螺原体,这类昆虫体内具有丰富的螺原体资源。而国内有关昆虫螺原体的研究很少。本研究的目标首先是调查我国虻蝇类昆虫体内螺原体的存在情况,初步了解螺原体的生物多样性和地理多样性。此外,螺原体引起的蜜蜂爬蜂病在我国发生普遍,其次是在测定蜜蜂螺原体SpiroplasmamelliferumCH-1基因组序列的基础上,选择蜜蜂螺原体致病过程中可能涉及的一些致病相关因子,应用生物信息学方法进行分析,并研究部分潜在致病相关基因的体外表达,为今后深入研究蜜蜂螺原体的致病机理奠定基础。主要研究结果有：第一,从江苏南京、浙江永康、广西桂林三地采集的110只牛虻和40只苍蝇样品中分离得到大量螺原体菌株。对其中分离自嗜牛原虻(Tabanusbovinus)的16株螺原体和分离自家蝇(Msucadomestica)的1株螺原体DCY1207-1的基本生物学特性进行了研究。17株螺原体在形态学,生理生化特性上基本一致。在对数生长期呈典型的螺旋状,呈翻滚式运动,菌体能通过孔径为0.22μm以及0.45μm的微孔滤膜,在固体培养基上的菌落呈颗粒状或者不规则状,生长的pH范围在5.2-10.2之间,最适pH在7.3左右;它们都能代谢葡萄糖和D-果糖,除NM1108-5、NM1208-5、NM1208-63株菌外其他菌株均能利用甘露醇；分离菌株均不能代谢精氨酸和尿素,生长速度较快,大约在18h就能达到对数生长期。单向血清学试验结果表明,牛虻螺原体与蜜蜂螺原体S.melliferumCH-1、引起乳鼠白内障的S.mirum及中华绒螯蟹颤抖病的S.eriocheiris的亲缘关系较远。第二,采用改良过的CTAB/NaCl法提取螺原体基因组,扩增16SrDNA序列。根据16SrDNA序列构建系统发育树,所有分离菌株分为2个进化支,分别为Apis和Citri-Chrysopicola-Mirum。大多虻蝇类昆虫螺原体菌株与S.turonicum聚类,且自展值接近100%;而NM1108-5,NM1208-6与S.gladiatoris聚类,NM1208-5与S.syrphidicola聚类。进一步利用转录间隔区序列(ITS)以及编码RNA聚合酶p亚基的基因(rpoB)作为基因Marker,进行系统发育学分析,验证了16SrDNA的分析结果,并能有效地区分不同虻蝇类螺原体菌株。根据分离菌株的生物学特性、部分血清学特性和系统发育学分析,将分离自牛虻的菌株NM1108-5、NM1208-6初步鉴定为S.gladiatoris,NM1208-5为S.syrphidicola.分离自家蝇的DCY1207-1和分离自牛虻的其他菌株NM1108-1等均初步鉴定为S.turonicum。第三,在测定了蜜蜂螺原体CH-1基因组序列的基础上,对蜜蜂螺原体所特有的几丁质酶基因进行生物信息学分析,结果表明：(a)不同细菌几丁质酶的氨基酸序列长度大小及其理化性质虽存在一定差异,但都含有5个保守氨基酸片段,分别是LGGAD,DIDLEQ,MAPEPYL,DAAA,MTWS。(b)螺原体几丁质酶无跨膜结构域,但有一个与Glycosylhydrolasesfamily18相匹配的功能结构域,具有降解碳水化合物的功能；其二级结构是以卷曲和α-螺旋为主要的结构元件,p-折叠和p-转角散布于整个结构,其目标蛋白序列与模型序列的相似度达到46.72%,可认为目标蛋白的三维结构与模型三维结构基本相似。(c)依据几丁质酶氨基酸序列构建的进化树分析,不同细菌几丁质酶的进化关系上可分为四大支；蜜蜂螺原体几丁质酶与其他细菌几丁质酶的亲缘关系较远。第四,经生物信息学分析,几丁质酶基因、几丁质脱乙酰基酶基因和P54蛋白基因是蜜蜂螺原体中3个可能与致病相关的基因。本研究成功克隆出这3个基因的全长,并在大肠杆菌中完整表达了几丁质脱乙酰基酶基因和P54蛋白基因,部分表达了几丁质酶基因,进一步证实螺原体CH-1中的TGA编码色氨酸而非终止密码子。本研究结果为今后进一步确定这些基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。
【作者】俞徐斌；
【导师】于汉寿；
【作者基本信息】南京农业大学，微生物学，2013，硕士
【关键词】牛虻；螺原体；生物学特性；生物信息学；致病相关因子；克隆表达；

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