嗜水气单胞菌金属蛋白酶克隆表达及致病特性分析

【摘要】嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是一种革兰阴性杆菌,常分布于淡水、土壤、污水及水产动物中,是人、畜和水生动物共患的条件致病菌,能引起水产动物出血性败血症,严重危害着我国水产养殖业。金属蛋白酶(metalloproteases)为一种细菌所分泌的胞外产物,属于一种蛋白酶类,其在一级结构上差异很大,但其活性中心较为保守、常含有金属离子(如锌、钴、镍等),其中以锌离子居多,且是一种依靠金属离子催化肽键水解的蛋白水解酶。大多数有毒力的金属蛋白酶都是以Zn2+为催化中心的。根据已发表的嗜水气单胞菌金属蛋白酶相关基因序列设计引物,以嗜水气单胞菌A.hydrophilaJ-1株基因组为模板,用PCR方法扩增得到了金属蛋白酶基因,并将其命名为ahMP.测序分析后发现,ahMP全长1281bp,包含一个可编码嗜水气单胞菌金属蛋白酶的完整ORF,大小为1266bp,可编码421个氨基酸,其中41个碱性氨基酸,51个酸性氨基酸,129个疏水性氨基酸,134个极性氨基酸。同源性分析后发现,与嗜水气单胞菌ATCC7966同源性为98%,与嗜水气单胞菌SSU和水族箱气单胞菌(Aeromonasaquariorum)AAK1同源性均为97%。ahMP基因含有金属蛋白酶的zinc活性位点共有序列,功能区位于151-161氨基酸；功能区氨基酸序列为HEXXHNMGLNH,其中X为任意氨基酸,Glu(谷氨酸)具有活性催化作用,并属于ZnMcSuperfamily(锌离子依赖的一类金属蛋白酶家族)。对155株气单胞菌检测发现,ahMP基因阳性率为21.94%；在嗜水气单胞菌中的分布率高达87.88%(29/33),说明ahMP基因在嗜水气单胞菌中广泛存在。利用PCR技术扩增ahMP基因全长,然后将其与载体质粒pET-32a(+)连接,成功构建出高效重组表达质粒pET32a-ahMP。再将重组质粒导入表达载体BL21(DE3),经双酶切鉴定后成功进行了蛋白的诱导表达,诱导表达结果显示,此重组蛋白以包涵体形式表达,蛋白大小为64kD。对复性后的纯化重组蛋白进行特性分析,此蛋白酶在42-56℃具有较高酶活性,且在50℃具有最大酶活性,而抑制剂1,10-菲咯啉、EDTA、SDS均能抑制其活性,使其酶活减少50%以上,而蛋白酶抑制剂PMSF对其活性没有明显抑制作用。Cu2+、Ca2+、Fe2+和Mg2+对其活性没有明显的抑制作用,而Zn2+抑制作用较为明显。上述结果说明本试验所得到的重组蛋白为一种具有热稳定性,且以锌离子为活性依赖中心的金属蛋白酶。采用重组金属蛋白酶对ICR小鼠和鲫鱼进行致病性试验。该蛋白酶对小鼠没有致死作用,但能使鲫鱼致死,并发现接种小鼠和鲫鱼的脏器都存在一定的病理损伤,主要表现为出血和坏死损伤,尤以肾脏最为严重。血液学指标检测显示,能引起机体白细胞数的下降,也对上皮细胞(EPC)具有细胞毒性。总之,该金属蛋白酶能降低机体白细胞数从而降低免疫力,同时对上皮细胞造成损伤,使细菌更容易入侵机体,并对机体能造成直接损伤。本研究为了解嗜水气单胞菌致病机理奠定了一定基础。
【作者】曹黛丽；
【导师】刘永杰；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】嗜水气单胞菌；ahMP基因；金属蛋白酶；特性分析；致病性；

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