表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）酶法乙酰化分子修饰及其产物的抗氧化性能研究

【摘要】表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)具有抗氧化、抗突变、防辐射、抗肿瘤、调节免疫和延缓衰老等卓越的生理活性。但是，其较高的亲水性和较低的亲脂性，极大的限制了EGCG在食品领域的应用，尤其是在油脂类食品中的应用。本文采用酶法分子修饰获得EGCG酰化产物以增加其脂溶性，通过分离纯化、结构表征，明确其酰化位点及最终产物结构，并对酰化产物的脂溶性和抗氧化性能进行评价。首先，确立了酰化EGCG酶法合成路线为以乙烯酯作为酰基供体的酯交换反应。不同碳链乙烯酯作为酰基供体对EGCG的转化率影响较大，随着碳链的增加，EGCG的转化率逐渐减小，EGCG与乙酸乙烯酯之间的酯交换反应能达到最高的转化率。采用响应面分析法对酶法制备乙酰化EGCG反应条件进行优化，最优条件为：脂肪酶LipozymeRMIM为酶催化剂，添加量为2.1%(w/w底物)；乙腈和异丙醇(质量比为1:1)为反应溶剂体系；40℃反应12h；EGCG与乙酸乙烯酯底物摩尔比为1.1。在该条件下，EGCG乙酰化转化率达到90.32%。采用液质联用选择离子分析明确了乙酰化EGCG反应产物为单-，二-和三取代乙酰化EGCG的混合物。在该反应体系中，脂肪酶LipozymeRMIM催化EGCG和乙酸乙烯酯的酯交换反应为动力学控制，在所研究的底物浓度范围内(EGCG浓度<15mmol/L，乙酸乙烯酯浓度<10mmol/L)，无底物抑制现象，反应遵循Michaelis-Menton方程，符合乒乓机制。采用高速逆流色谱(HSCCC)与高效制备液相色谱对乙酰化EGCG粗产品进行分离纯化。确定HSCCC分离条件为:上相为固定相，下相为流动相，采用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=1.5:5:1.5:5(v/v)为溶剂系统，分离温度为20℃，转速为700r/min，流动相以5mL/min的流速从首端进行洗脱。分离产物经过质谱和核磁共振鉴定分别为5″-O-乙酰基EGCG，3″,5″-2-O-乙酰基EGCG和5′,3″,5″-3-O-乙酰基-EGCG，确定了在脂肪酶LipozymeRMIM催化作用下，EGCG发生酰化的位点是B环的5′位和D环的3″,5″位。通过溶解度实验，透光率实验和油水分配系数(LogP)测定表明，乙酰化EGCG的脂溶性得到明显提高，30℃时在大豆油中溶解度为397mg/kg。色差实验表明在添加量为200mg/kg时，乙酰化EGCG对植物油色泽和亮度没有明显影响。采用过氧化值法和Rancimat仪方法考察并比较了乙酰化EGCG、未改性EGCG、2,6-二特丁基对甲酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)在不同油脂油中的抗氧化性能。结果表明，乙酰化EGCG在油脂中具有良好的抗氧化性，在添加量相同时，乙酰化EGCG在油脂中的抗氧化活性要高于未改性EGCG、BHT，略低于TBHQ。乙酰化EGCG产物的溶剂残留符合欧洲药典标准，安全可靠。在添加乙酰化EGCG后，油脂的理化指标没有改变。通过测定乙酰化EGCG对超氧阴离子自由基(O2·-)、羟基自由基(·OH)、DPPH自由基的清除能力，研究其体外抗氧化活性，结果表明，乙酰化EGCG对O2·-、·OH、DPPH·均具有较强的清除能力，半抑制率(IC50)分别为0.52mg/mL、0.43mg/mL和11.5mg/L。体外抗脂质过氧化实验表明当乙酰化EGCG浓度为320mg/L时，对H2O2和Fe2+诱导大鼠肝线粒体丙二醛(MDA)生成的抑制率分别为69.44%和74.77%，对H2O2诱导大鼠红细胞氧化溶血的抑制率达93.54%。乙酰化EGCG具有良好的体外抗氧化活性，其浓度与抗氧化活性呈现一定的量效关系。
【作者】朱松；
【导师】王洪新；
【作者基本信息】江南大学，食品科学，2014，博士
【关键词】表没食子儿茶素没食子酸酯；乙酰化；脂肪酶；亲脂性；抗氧化；

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