叶酸修饰聚（2-乙基-2-噁唑啉）-b-聚己内酯靶向胶束的制备及其在肿瘤治疗中的应用

【摘要】当前肿瘤治疗的形势日益严峻,发病率和死亡率逐年升高。现有的抗肿瘤药物治疗效果不佳,主要是因为它们存在溶解度低、稳定性差、缺乏靶向性、产生耐受性等问题。为了解决这些问题,本文设计并合成了一种以叶酸(FA)为主动靶向基团,以聚2-乙基-2-嗯唑啉(PEOz)为亲水外壳,以聚己内酯(PCL)为疏水内核的聚合物胶束,对其在化疗药物和光热治疗药物的靶向药物传递方面的应用进行了研究。主要研究内容如下：一.通过两步开环反应合成了两亲性嵌段共聚物Boc-NH-PEOz-PCL,在此基础上进行叶酸偶联,得到了具有主动靶向功能的聚合物FA-PEOz-PCL。利用傅立叶红外、核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱、差示扫描量热法和X射线衍射表征了聚合物的结构,采用芘荧光探针法、透射电镜和动态光散射研究了聚合物在水中的胶束化行为,通过测定溶血率对聚合物的安全性进行了初步的评价。结果表明,产物的结构确证,反应可控。Boc-NH-PEOz-PCL和FA-PEOz-PCL在水中能够自组装形成球形或类球形的胶束,分散良好,平均粒径在100nm左右,临界胶束浓度分别为0.012g·L-1和0.007g·L-1。聚合物的溶血率低于5%,生物相容性良好。二.以化疗药物阿霉素作为模型药,采用透析法制备了普通载药胶束(DM)和主动靶向载药胶束(FDM),对这两种胶束进行了体内外评价。结果显示,DM和FDM的载药量分别为12.9%和10.2%,平均粒径为162nm和187nm,Zeta电位呈电中性,阿霉素在胶束中呈无定形状态。采用透析法考察了阿霉素胶束的体外释放。结果表明在pH7.4释放介质中,DM在60h内累积释药量为15.5%,FDM累积释放量为31.9%。而在pH5.5的释放介质中,两种胶束释药速度均明显加快,60h内释放量分别为37.6%和64.8%。利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪考察了阿霉素胶束的细胞摄取,通过MTT法考察了阿霉素胶束的细胞毒性。结果显示,对于叶酸受体表达过量的Hela和KB细胞,FDM的细胞摄取和细胞毒性均明显强于DM,而对于叶酸受体表达阴性的A549细胞,FDM和DM的细胞摄取和细胞毒性没有显著性差异。进一步的研究表明,加入游离叶酸明显抑制FDM的细胞摄取和毒性,提高胶束表面的叶酸修饰程度,胶束的抗肿瘤活性随之增强。选择MCF7/ADR细胞株为耐药株模型,考察了阿霉素胶束对耐药株细胞的抑制作用。结果显示,DM和FDM与细胞孵育3h后的细胞摄取量分别为游离阿霉素摄取量的3.1和5.1倍,孵育48h之后的细胞毒性分别为游离阿霉素的5.0和7.2倍,说明它们具有明显的克服耐药的作用。以荷KB肿瘤的裸鼠为动物模型考察了阿霉素胶束的体内抑瘤效果。静脉注射给药35天后,FDM的平均抑瘤率为53.3%,优于DM(37.8%)和游离阿霉素(45.1%)。小鼠体重监测数据显示,游离阿霉素引起小鼠体重明显下降,而阿霉素胶束组小鼠未出现明显的体重异常,说明阿霉素胶束能有效地降低游离阿霉素的全身毒性。三.以近红外染料吲哚菁绿(ICG)为模型药,采用有机溶剂挥发法制备了包载ICG的普通载药胶束IM和主动靶向载药胶束FIM,对胶束的近红外成像和光热治疗应用进行了研究。研究表明,IM和FIM的平均粒径分别为28.2nm和43.8nm,形态为球形且分散良好。与游离ICG相比,胶束内的ICG的光学稳定性有明显提高,这主要得益于胶束的保护作用。利用激光共聚焦显微镜观察了IM和FIM的细胞摄取。结果表明,对于Hela和KB细胞,FIM的细胞摄取程度明显大于IM；而对于A549细胞,FIM和IM的细胞摄取量相当。以荷KB肿瘤的裸鼠为模型进行了活体近红外成像实验。成像照片显示,游离ICG在体内被快速清除,肿瘤部位信号分辨率低。而静脉注射FIM24h后,在KB肿瘤部位发现高分辨率的近红外信号,且信号可维持7天以上。半定量分析结果显示,FIM在肿瘤的信号强度分别是在肝脏和背景信号强度的2.5倍和5倍左右,体现了FIM优良的靶向性和近红外成像效果。采用MTT法考察了体外光热细胞毒性。单独使用ICG制剂或激光照射对KB细胞生长没有影响,但两者结合产生显著的光热细胞毒性。在功率为1.95W·cm-2的激光照射下,包裹1.25μg·mL-1ICG的FIM的细胞生长抑制率为40%；当ICG浓度提高到20μg·mL-1时,产生的光热效应能将全部细胞杀死。进一步的实验发现,光热细胞毒性还与激光照射时间和功率正相关。通过Hoechst/PI双染实验进一步确证了FIM的光热细胞毒性,并且揭示了光热治疗的机理为温度依赖的凋亡和坏死。当温度较低时,主要机理为凋亡；而当温度较高时,光热主要造成细胞坏死。以荷KB肿瘤的裸鼠为动物模型考察了体内光热抑瘤效果。瘤内注射FIM然后用1.95W.cm-2激光照射10min可以使肿瘤完全消融；静脉注射2mg-Kg-1FIM外加激光照射的肿瘤抑制率为72.6%,显著优于同样治疗条件下的IM组(44.8%)和游离ICG组(25.0%)。组织学考察结果发现,FIM组的肿瘤切片中出现了明显的凋亡和坏死特征,进一步证实了FIM的光热治疗效果。裸鼠体重数据表明,各实验组的裸鼠体重都很正常,初步说明这些制剂具有较低的全身毒性。
【作者】鄢璐；
【导师】邱利焱；
【作者基本信息】浙江大学，药剂学，2014，博士
【关键词】胶束；主动靶向；叶酸；阿霉素；吲哚菁绿；光热治疗；

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