自噬及PARP-1对鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性影响的实验研究

【摘要】第一部分沉默自噬相关基因ATG5对鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的影响[目的]本部分通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制自噬相关基因ATG5的表达,观察ATG5沉默后对鼻咽癌CNE-2细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响,以探讨自噬与鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的关系,为鼻咽癌放射增敏及基因治疗提供新的靶点。[方法]针对自噬相关基因ATG5设计并合成3条干扰靶点,筛选最佳沉默片段进行慢病毒包装,感染鼻咽癌CNE-2细胞并经流式分选获得稳定沉默的细胞株。应用RT-PCR及Western-blot实验验证干扰效果。采用CCK-8法、流式细胞技术和克隆形成实验检测自噬相关基因ATG5沉默后鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的变化。同时,进行裸鼠成瘤体内试验,观察ATG5基因沉默后,射线照射对裸鼠移植瘤生长的影响,进一步验证自噬与鼻咽癌放射敏感性的关系。[结果]CCK-8实验结果显示,与未转染的Control组和阴性对照NC组相比,各剂点ATG5沉默组的细胞存活率均显著降低(P<0.05),绘制细胞生存曲线可见下调ATG5的表达后可以增加CNE-2细胞的放射敏感性。流式细胞术结果显示,经6Gy射线照射后,与NC组及Control组相比,ATG5沉默组细胞的凋亡指数明显升高(F=394.876,P<0.01)。克隆形成实验结果显示,在各照射剂量点,ATG5组的细胞存活分数较Control及NC组均有所下降(P<0.05),二次线性模型拟合剂量存活曲线示沉默ATG5基因可增加鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性。裸鼠成瘤体内实验结果显示,经10Gy射线照射后,与Control及NC组相比,ATG5组移植瘤的生长明显减缓,ATG5组瘤体重量明显小于其他两组(F=4.035,P<0.05)。[结论]沉默自噬相关基因ATG5可以增加鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性,初步判断自噬是鼻咽癌CNE-2细胞放射过程中的一种保护性机制。第二部分沉默PARP-1基因对鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的影响[目的]本部分采用慢病毒介导的RNA干扰技术抑制基因PARP-1的表达,观察其沉默后对射线所致的自噬现象及鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的影响,进一步探讨PARP-1与自噬及鼻咽癌放射敏感性的关系,为寻找鼻咽癌放射增敏途径提供理论基础。[方法]针对基因PARP-1设计并合成的3条干扰靶点,进行慢病毒包装,应用RT-PCR及Western-blot实验筛选出沉默效果最佳的靶点,感染目的细胞CNE-2并流式分选获得稳定沉默PARP-1基因的细胞株。Western-blot实验分别检测PARP-1及ATG5基因沉默的CNE-2细胞射线照射前后LC3-Ⅱ、ATG5及PARP-1蛋白的变化情况,研究PARP-1与自噬的关系。另外应用CCK-8法、流式细胞术及克隆形成实验检测]PARP-1基因沉默后鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的变化。[结果]Western-blot实验结果显示,经10Gy射线照射,PARP-1基因沉默组LC3-Ⅱ的相对表达量较单纯照射组明显降低(F=34.856,P<0.01),这一现象在ATG5沉默组中也有相似表现。同时,沉默PARP-1基因后,PARP-1蛋白的相对表达量较单纯照射组降低(F=14.853,P<0.01),ATG5的蛋白表达量也相应降低(F=10.863,P<0.01),而沉默自噬相关基因ATG5后,ATG5蛋白的表达量有所降低,PARP-1的表达却未受影响。CCK-8实验结果显示,降低PARP-1的表达后各实验组细胞的存活率均有所降低(P<0.05),绘制细胞生存曲线可见下调PARP-1的表达后可增加CNE-2细胞的放射敏感性。流式细胞术结果显示,经6Gy射线照射后,与NC组及Control组相比,PARP-1沉默组细胞的凋亡率明显升高(F=501.048,P<0.01)。克隆形成实验结果显示,各剂量点PARP-1沉默组细胞的存活分数均有所降低(P<0.05),二次线性模型拟合剂量存活曲线示下调PARP-1的表达后可以增加鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性。[结论]射线可以诱导PARP-1的激活。PARP-1参与了射线所致的鼻咽癌CNE-2细胞的自噬现象,且可能处于相应信号通路的上游。PARP-1基因表达量的降低增加了CNE-2细胞对射线的敏感性,即PARP-1在射线所致鼻咽癌CNE-2细胞死亡过程中起保护性作用。
【作者】卢小迪；
【导师】朱小东；
【作者基本信息】广西医科大学，肿瘤放射治疗学，2014，博士
【关键词】自噬；ATG5；RNA干扰；放射敏感性；鼻咽癌；CNE-2细胞；PARP-1；

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