原小檗碱类生物碱与CYP450和药物转运体的相互作用研究

【摘要】细胞色素P450(CYP450)是人体内最重要的一相代谢酶之一,参与机体内大部分外源性、内源性物质的代谢,主要催化氧化、过氧化等反应。CYP450酶主要分布在生物体的肝脏中,介导了人体内大量药物的代谢,其中与药物代谢关系比较密切的CYP450主要有CYP1A2,2A6,2C8,2C9,2C19,2D6,2E1和3A4/5。如果药物对代谢酶有抑制或诱导作用,就有可能干扰同时服用的其它药物在体内的代谢动力学过程,导致代谢性相互作用。据目前的统计,临床上90%以上的代谢性药物相互作用(DDI)都是由CYP450酶活性的改变引起的。ATP依赖型(ATP-bindingcassettes,ABC)转运体是人体内最大的跨膜转运体超家族之一,通过ATP酶水解ATP,以获取能量,用于运输或外排多种有机分子,包括许多药物。这其中与药物转运密切相关的主要包括P-糖蛋白(ABCB1/P-gp/MDR1),多药耐药相关蛋白(ABCCs/MRPs)1-5和乳腺癌耐药蛋白(ABCG2/BCRP)。已有很多临床资料说明P-gp,MRPs和BCRP在药物处置中发挥着重要的作用。另外,P-gp,MRP1和BCRP在肿瘤细胞中的高表达是引起多药耐药性(MDR)导致化疗失败的一个重要原因。有机阳离子转运体OCT3(SLC22A3)是转运各种内源性和外源性有机阳离子的转运体,属于溶质运载(Solutecarrier,SLC)转运体超家族。OCT3的底物谱广泛,包括许多内源性化合物如单胺类神经递质,以及一些临床用药如二甲双胍,奎尼丁和拉米夫定等。OCT3在生物体内的分布广泛,在许多生理病理活动中发挥作用。近年来在中枢神经系统的功能和疾病,如抑郁症,OCT3的作用被越来越多的研究所证实,并被认为是抗抑郁治疗中的一个重要的靶点。原小檗碱类生物碱是一种在植物中广泛存在的生物碱。研究表明原小檗类生物碱具有许多药理活性,其中在临床上使用较为广泛的是小檗碱和延胡索乙素(THP),前者用于治疗腹泻,后者用于镇痛(THP有一个手性碳原子,左旋THP是起镇痛作用的主要构型)。最近有研究表明,小檗碱在动物实验中表现出抗抑郁样作用。在代谢方面,目前尚无研究考察THP的两个对映体对CYP450和ABC药物转运体的抑制作用。原小檗类生物碱作为有机阳离子,与OCT3是否存在相互作用也未见报道。因此本文研究了THP对映体与CYP450和ABC药物转运体的相互作用,以及原小檗碱类生物碱与OCT3的相互作用。本文还研究了THP对映体在逆转肿瘤MDR中的作用,以及小檗碱及其体内转化产物药根碱的抗抑郁作用和OCT3的联系。1.鸡尾酒法考察延胡索乙素对映体对人CYP450代谢酶的抑制作用为了考察THP对映体对人CYP450代谢酶的抑制作用,探讨其与其它药物发生代谢性相互作用的可能性,本章建立了针对人CYP1A2,2A6,2C8,2C9,2C19,2D6,2E1和3A4/5代谢活性筛查的体外鸡尾酒探针底物法。采用的探针底物分别为非那西丁(1A2),香豆素(2A6),紫杉醇(2C8),甲苯磺丁脲(2C9),奥美拉唑(2C19),右美沙芬(2D6),氯唑沙宗(2E1),睾酮和咪达唑仑(3A4/5)。检测方法为LC-MS/MS,除了香豆素测定原型减少量外,其余探针均测定相应的代谢产物生成量。方法学验证结果显示,所有检测物质的响应在一定范围内与浓度呈良好的线性关系,方法回收率在100±15%以内,精密度RSD<15%,均符合要求。应用该方法考察THP对映体对人肝微粒体中CYP1A2,2A6,2C8,2C9,2C19,2D6,2E1和3A4/5的抑制作用。结果显示,除CYP2A6底物香豆素的代谢不受THP对映体的影响外,CYP1A2,2C8,2C9,2C19,2D6,2E1和3A4/5对经典底物的代谢均被THP不同程度抑制。其中,THP对映体对CYP1A2,2C8,2C9,2C19,2E1和3A4/5的抑制作用较弱(100μM时抑制率不到50%)。THP对映体对CYP2D6的抑制表现出一定的立体选择性差异,(-)-THP对CYP2D6底物右美沙芬代谢的抑制作用较强,而(+)-THP的抑制作用较弱。进一步测定(-)-THP抑制右美沙芬的Ki为6.42±0.38μM。由于(-)-THP在大鼠肝脏中的组织分布浓度较高,推测其与CYP2D6底物合用时可能引发药物-药物相互作用。2.延胡索乙素对映体与ABC转运体的相互作用研究在研究过THP对映体对CYP450代谢酶的抑制作用后,本章继续考察THP对映体对ABC转运体的作用。在MDCK-MDRl,MDCK-MRP1和LLC-PKl-BCRP细胞模型上,以相应的底物：罗丹明123(R123),钙黄绿素和瑞舒伐他汀的积聚量考察THP对映体对P-gp,MRP1和BCRP转运活性的抑制作用。结果显示,THP对映体对MRP1和BCRP没有抑制作用,对P-gp有抑制且存在立体选择性,(+)-THP的抑制作用强于(-)-THP。采用MDCK-MDR1细胞单层膜模型,进一步考察THP对映体对R123转运的抑制作用,获得IC50值：(+)-THP为19.99μM,(-)-THP为48.63μM。同时,THP对映体在MDCK-MDR1和MDCK细胞单层膜上的双向转运实验结果表明,THP对映体的被动扩散较强,难以判断其是否为P-gp的底物。考虑到THP对映体在大鼠肝脏中的组织分布浓度较高,且P-gp在肝脏中表达量较高,推测其与P-gp底物合用时可能引发药物-药物相互作用。采用WesternBlot和Real-timePCR的方法,考察经过THP对映体处理48h后,P-gp高表达的K562/ADR细胞中P-gp表达量的变化。结果显示,THP对映体能够降低P-gp蛋白层面的表达,但在所考察的浓度范围内(20-80μM),未显示浓度依赖性,而对P-gpmRNA的表达未表现出明显的影响,提示THP对映体可能是在转录后或者翻译水平对P-gp的蛋白表达进行调节的。基于ABC转运体不仅在DDI中发挥着重要作用,还与临床上化疗药物治疗后肿瘤细胞的多药耐药性(MDR)有着密切联系。我们在多药耐药肿瘤细胞K562/ADR和MCF-7/ADR上进行MTT实验结果显示,与阿霉素与空白溶剂联用组比较,(-)-THP及(+)-THP和阿霉素合用后,肿瘤细胞生存率明显降低,阿霉素的细胞毒性作用明显增强。而且,与对P-gp的抑制作用一致,(+)-THP的作用略强于(-)-THP。上述结果提示THP对映体作为P-gp的抑制剂,显示出一定的提高MDR肿瘤细胞敏感性的能力,为其在肿瘤化疗中发挥作用提供了理论依据。3.稳定表达人有机阳离子转运体OCT3的细胞模型构建及其在研究原小檗碱类生物碱摄取中的应用鉴于延胡索乙素等原小檗碱类生物碱均为有机阳离子,与有机阳离子转运体3发生相互作用的可能性较大,因此本章采用脂质体转染和有限稀释法,构建了稳定表达人有机阳离子转运体OCT3的MDCK细胞模型来进行研究。采用4-Di-1-ASP+,MPP+和二甲双胍三种经典底物进行摄取实验验证,挑选出对三种底物的摄取活性均较好的细胞株作为MDCK-hOCT3进行后续实验。采用构建好的MDCK-hOCT3细胞模型研究原小檗碱类生物碱的摄取。研究的原小檗碱类生物碱包括小檗碱、黄连碱、药根碱、表小檗碱、小檗红碱、巴马汀、延胡索乙素和延胡索甲素。其中小檗碱、黄连碱、药根碱和表小檗碱在MDCK-hOCT3细胞中的摄取较空载体细胞中的摄取有所增强(孵育10min时,约3-10倍),表现出底物特性。进一步测定它们的摄取动力学参数,获得小檗碱、黄连碱、药根碱和表小檗碱的Vmax(pmol/mgprotein/min)分另别为44.7±1.2,57.5±1.8,16.5±0.38和4.04±0.16,Km(μM)分另别为2.17±0.20,0.351±0.034,0.453±0.042和0.273±0.032,CLint(Vmax/Km)分别为20.6,164,36.4和14.8。4.原小檗碱类生物碱对人OCT3的抑制作用及小檗碱、药根碱的抗抑郁作用研究本章采用MDCK-hOCT3细胞模型考察原小檗碱类生物碱对hOCT3介导的MPP+摄取的抑制作用,结果显示本研究中的所有原小檗碱类生物碱对hOCT3介导的MPP+摄取均有抑制作用,其中黄连碱的抑制能力最强,而(+)-THP的抑制能力最弱。具体的IC50值如下：小檗碱为9.87μM,黄连碱为2.15μM,药根碱为4.92μM,表小檗碱为2.27μM,小檗红碱为4.88μM,巴马汀为17.3(-)-THP为21.0μM,(+)-THP为28.4μM,延胡索甲素为21.1μM。基于文献报道小檗碱有抗抑郁样活性,本研究考察了小檗碱和其在体内的代谢转化产物药根碱的抗抑郁作用。在MDCK-hOCT3细胞模型上,小檗碱和药根碱对hOCT3介导的5-HT和NE摄取均有抑制作用,针对5-HT摄取的IC50值：小檗碱为0.225μM,药根碱为0.122μM。针对NE摄取的IC50值：小檗碱为0.566μM,药根碱为0.205μM。进一步应用小鼠脑突触小体模型,进行的5-HT和NE摄取实验结果显示,小檗碱和药根碱对两者的摄取均有抑制作用(50μM下,抑制率在20-30%左右),且具有浓度依赖性,uptake-2在其中发挥了重要作用。在悬尾实验中,小鼠腹腔注射5,10和20mg/kg药根碱后表现出抗抑郁样作用,具有统计差异。上述结果有助于探究小檗碱的抗抑郁作用机制并拓展药根碱的药理活性。
【作者】孙思源；
【导师】蒋惠娣；曾苏；
【作者基本信息】浙江大学，药物分析学，2013，博士
【关键词】原小檗碱类生物碱；CYP450；P-糖蛋白(P-gp)；有机阳离子转运体OCT3；

【参考文献】
[1]王征.“控制”之美[J].南京艺术学院学报(美术与设计版),2014,03:99-101.
[2]孙丽娇.图的非正常L（p，q）-标号和非正常L（p，1）-全标号的研究[D].山东师范大学,应用数学,2013,硕士.
[3]左中峰.一种新结构低速永磁电机的设计与性能的仿真研究[D].北京交通大学,电气工程（专业学位）,2013,硕士.
[4]张蕾.骨髓间充质干细胞在宿主心肌内结构演化及影响因素的探讨[D].重庆医科大学,儿科学,2004,硕士.
[5]杨柳.社会心理因素对多囊卵巢综合征发生发展的影响[D].河北医科大学,儿少卫生与妇幼保健学,2014,硕士.
[6]邹翔.我国检察机关侦查权研究[D].南昌大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[7]周霞.人类学视野下宁夏回族生态移民社会文化适应研究[D].宁夏大学,人类学,2014,硕士.
[8]罗丰雷.芒果果实活性物质分离纯化、鉴定及生物活性研究[D].浙江大学,果树学,2014,博士.
[9]刘贝贝,林建成.增强大学生政治认同的社会心理学路径探析[J].学理论,2014,15:76-77.
[10]陈蔚.浅谈CD唱片封面设计中男女歌者的差异[J].美术教育研究,2014,14:74-75.
[11]万承凤.DSCT双能量技术在痛风性关节炎诊断中的初步应用[D].福建医科大学,影像医学与核医学,2014,硕士.
[12]董钊.块茎成像监测系统的激励/测量策略研究[D].北京交通大学,2015.
[13]刘军.基于时变t-Copula的沪深股指组合的风险度量[D].西南交通大学,金融学,2013,硕士.
[14]景丽.长江下游干流中华绒螯螯种群特征的研究[D].南京农业大学,水产养殖,2012,硕士.
[15]姜敏.脐带缠绕的临床分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[16]薛维炎.太钢4号高炉大修炉体系统设计[J].炼铁.2001(04)
[17]马银玲.口腔固定义齿数字化设计技术研究[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2014,硕士.
[18]张秀智,丁锐.经济欠发达与偏远农村地区宅基地退出机制分析:案例研究[J].中国农村观察,2009,06:23-30+94-95.
[19]杭的平.4000kN·m能级强夯黄土边坡动态响应规律的研究[D].中北大学,工程力学,2014,硕士.
[20]陈德军,张玉民,陈绵云.数据挖掘的系统云灰色预测方法研究[J].控制与决策,2004,08:907-910.
[21]耿涛.外商在华直接投资的股权结构影响因素研究[D].上海社会科学院,世界经济,2012,硕士.
[22]邢霁远.慢性乙型肝炎肝脏炎症和纤维化中CaM、Bad蛋白变化影响的研究[D].郑州大学,内科学,2013,硕士.
[23]陈培敏.超声技术在臂丛神经阻滞应用中的临床研究[D].苏州大学,外科学,2013,博士.
[24]段炼.基于运行模式的风电电力系统概率潮流分析[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[25]刘秀晨.那年,我在饮虎池抓螃蟹[J].北京政协.1996(12)
[26]隋伟.赛艇运动员常用训练手段测试时积分肌电、平均功率频率变化特征研究[D].首都体育学院,体育教育训练学,2013,硕士.
[27]杜文玉.复杂TIG电弧多物理场全耦合数值分析[D].兰州理工大学,材料加工工程,2014,硕士.
[28]刘德峰.东升庙采空区稳定性的监测、预报及控制技术研究[D].内蒙古科技大学,采矿工程,2014,硕士.
[29]李胜文.胆红素对实验性肺气肿支气管上皮细胞的影响[D].山西医科大学,呼吸内科,2003,硕士.
[30]夏正强.双四唑—铜（Ⅰ/Ⅱ）配合物的合成、表征及性质[D].西北大学,材料化学,2013,硕士.
[31]朱思源.高速铁路对沿线城市可达性的影响研究[D].北京交通大学,2014.
[32]张红云,石阳,马垣.数据挖掘中聚类算法比较研究[J].鞍山钢铁学院学报,2001,05:364-367+371.
[33]周辉.基于感知风险视角的网络购物从众行为研究[D].浙江大学,2014.
[34]刘涛.高尔基体驻膜糖蛋白GP73启动子的研究及其在靶向肝癌腺病毒治疗中的应用[D].浙江理工大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[35]付明俊.痰湿型多囊卵巢综合征患者遗传因素和生活方式的分析[D].黑龙江中医药大学,中医妇科学（专业学位）,2013,硕士.
[36]轩斯文.论类似必要共同诉讼制度在我国的构建[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[37]刘秋芳.预应力钢—混凝土组合连续梁预加力效应研究[D].福州大学,结构工程,2004,硕士.
[38]奚晓蕾.医院文化对员工满意度影响的分析研究[D].复旦大学,公共卫生,2012,硕士.
[39]郑友强.古希腊哲学认识论简论[D].中央民族大学,马克思主义哲学,2004,硕士.
[40]徐富贤,郑家奎,朱永川,王贵雄,杨大金,刘康.川东南杂交中稻超稀栽培对稻米整精米率和垩白粒率的影响[J].植物生态学报,2004,05:686-691.
[41]张忠祥.固体氧化物燃料电池Ni基阳极的硫毒化及再生研究[D].哈尔滨工业大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[42]李海锋.骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎的可行性研究[D].山西医科大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[43]邹华.江苏SMS公司投资价值分析[D].南京大学,工商管理,2013,硕士.
[44]武文良.薄膜电子式及压电智能式电气转换器控制系统的研制[D].大连理工大学,机械电子,2003,硕士.
[45]章国政.构建小微企业多层级金融服务体系的探讨[D].上海交通大学,高级工商管理（EMBA）,2013,硕士.
[46]刘友宏,杜力伟,李腾,邵万仁,徐速,邓洪伟.非对称波瓣下外扩张角对S型喷管气动热力性能影响[J].推进技术,2015,05:1.
[47]叶鸿伟.V公司二手车营销战略研究[D].首都经济贸易大学,企业管理,2014,硕士.
[48]白友良.罗布泊西北缘72.4～51.0kaB.P.气候与环境变化[D].兰州大学,构造地质学,2013,硕士.
[49]陈达.横向价格垄断协议案定性处理中的焦点问题分析策略——以西部L市旅行社横向价格垄断协议案为例[J].价格理论与实践,2015,03:31-34.
[50]裴瑞凌.智能工厂流程模拟仿真平台IntelSim的设计[D].浙江大学,2005.