胞内段氨基酸序列对corin在细胞膜锚定及活化的影响

【摘要】目的：Corin是心脏中发现的一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶（TypeIITransmembraneSerineProtease，TTSP），通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上。与许多丝氨酸蛋白酶一样，corin以无活性酶原形式在核糖体中合成，经内质网、高尔基体，锚定在细胞膜上，从而发挥其生物学功能。现有文献报道，某些跨膜蛋白的胞内近膜区氨基酸序列在其细胞膜锚定与活化中起重要作用。Corin蛋白含有一个短的氨基端胞质尾部，有研究表明人corin蛋白氨基端胞内段的“天冬氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺”（Asp-Asp-Asn-Asn，DDNN）基序，可以影响corin蛋白在细胞膜的锚定和活化。但是，小鼠corin胞内段不含有DDNN基序，长短也不同于人corin。因此，我们推断小鼠corin胞内段可能存在其它的影响corin在细胞膜锚定与活化的序列。目前尚未有相关研究报道。本课题中我们从胞内段近膜区的氨基酸序列和跨膜区胞内侧的电荷两方面，在国内外率先开展工作，研究胞内段结构对小鼠corin在细胞膜的锚定与活化的影响，从而阐明corin的结构与功能的关系，揭示II型跨膜丝氨酸蛋白酶在细胞膜锚定的机制。方法：（1）以小鼠野生型corin质粒mE1a为模板，用VectorNTI软件设计引物，利用PCR定点突变技术（QuikChangeLightningSite-DirectedMutagenesisKit）构建一系列胞内段截短型corin表达载体及其它corin突变体。（2）将野生型及突变corin质粒转染人胚肾（humanembryonickidney，HEK）293细胞，制备细胞裂解液，蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测重组corin蛋白在细胞浆内的表达及活化情况。（3）利用生物素标记细胞膜蛋白和流式细胞术检测截短型/突变体corin在细胞膜表面的表达情况。（4）将野生和突变corin表达质粒转染到pro-ANP稳定表达的HEK293细胞中，Westernblotting检测上清中的pro-ANP和ANP，评估基因突变对corin功能的影响。结果：（1）我们分别去掉胞内段50和99个氨基酸残基，构建小鼠截短型corinmD50和mD99表达载体。转染HEK293细胞，Westernblotting检测细胞裂解液中corin的表达与活化，与野生型corinmE1a相比，mD50对corin蛋白的表达和活化都没有影响，mD99对corin蛋白表达没有影响，但是，mD99corin蛋白的活化量显著增加（29.00±0.32%vs.12.48±1.89%，p=0.0001，n=4）。我们还分别用生物素标记细胞表面蛋白和流式细胞术检测corin在细胞膜的表达，发现mD99在细胞膜上的表达量显著增加。结果提示：氨基端胞内段第50到第99个氨基酸之间存在抑制小鼠corin蛋白在细胞表面表达和活化的序列。（2）我们再分别去掉胞内段60、70和75个氨基酸，构建表达载体mD60、mD70和mD75。转染HEK293细胞，Westernblotting检测corin的表达与活化，发现这些突变不影响corin在细胞内的表达，但与野生型corinmE1a相比，mD75的活化显著增加（28.73±0.01%vs.16.63±0.04%，p=0.02，n=3）。流式细胞术检测也发现转染mD75的HEK293细胞表面corin阳性率明显高于野生型corinmE1a(76.34±4.43%vs.40.04±5.10%，p=0.0017，n=4）。据此，我们推测抑制序列位于第70到第75个氨基酸之间。（3）基于上述结论，我们再从胞内段依次去掉71、72、73和74个氨基酸，构建表达载体mD71、mD72、mD73和mD74。转染HEK293细胞，Westernblotting检测发现，与野生型corinmE1a相比，突变体在细胞内的表达未受影响，但mD72、mD73和mD74corin蛋白的活化量显著增加。推断：氨基端胞内段第72位的苯丙氨酸可能对小鼠corin蛋白在细胞膜锚定活化起重要作用。再以mE1a为模板，分别将71位赖氨酸（Lys，K）、72位苯丙氨酸（Phe，F）和73位的谷氨酰胺（Gln，Q）突变成丙氨酸（Ala，A），即K71A、F72A和Q73A，并构建表达载体K71A/F72A/Q73A。质粒转染HEK293细胞，Westernblotting检测发现突变体K71A、F72A和Q73A对corin的表达和活化都没有影响，而K71A/F72A/Q73A不影响corin的表达，但与野生型corinmE1a相比，活化量显著增加（28.69±1.29%vs.19.58±1.42%，p=0.009，n=3）。提示氨基端胞内段第71、72和73位的KFQ基序可以抑制小鼠corin蛋白在细胞膜上的表达和活化。（4）为研究小鼠corin蛋白锚定到细胞膜上最少需要几个氨基酸残基，我们以mE1a为模板，从小鼠corin的胞内段依次去除106、111和112个氨基酸残基，构建mD106、mD111和mD112。转染HEK293细胞，研究发现这些突变不影响corin在细胞内的表达，但corinmD112不能被活化；流式细胞术检测也发现突变体mD112几乎不在膜上表达；Westernblotting检测corin的功能，也发现mD112不能将pro-ANP活化为ANP，即不具有生物学功能。说明小鼠corin蛋白氨基端胞内段起始氨基酸甲硫氨酸（methionine，Met）和膜内侧的精氨酸对corin在细胞膜锚定非常重要。（5）我们还进一步研究了胞内侧氨基酸的电荷对小鼠corin蛋白在细胞膜上的锚定和活化的影响。以mD111为模板，把胞内段第112位精氨酸（Arg，R）突变成丙氨酸（Ala，A）、天冬氨酸（Asp，D）和赖氨酸（Lys，K）分别得到突变体D-R112A、D-R112D和D-R112K。转染HEK293细胞，发现突变对corin在细胞内的表达没有影响。但是D-R112A和D-R112Dcorin蛋白不能被活化，而精氨酸变成同样带正电荷的赖氨酸之后，D-R112Kcorin蛋白可以正常被活化。流式细胞术检测也发现只有胞内段氨基酸带正电荷时，corin蛋白才能在膜上表达并具有生物学功能。从而推测，corin蛋白在胞内段除起始甲硫氨酸外，只需要一个带正电荷的氨基酸就可以锚定到细胞膜上。为了进一步验证我们的结论，我们以mE1a为模板，分别把112位精氨酸（Arg，R）突变成丙氨酸（Ala，A）、天冬氨酸（Asp，D）、谷氨酸（Glu，E）、赖氨酸（Lys，K）和组氨酸（His，H），得到突变体R112A、R112D、R112E、R112K和R112H。质粒转染HEK293细胞，Westernblotting和流式细胞术检测都证实当112位是正电荷氨基酸时，corin蛋白可以在细胞膜上锚定和活化，变成带负电荷或者中性氨基酸时，corin蛋白就不能锚定到细胞膜上。结论：（1）KFQ基序是小鼠corin蛋白胞内段存在的一个抑制corin向细胞膜转运及活化的信号。（2）小鼠corin蛋白仅需要一个位于胞内段112位精氨酸就可以锚定到质膜上被活化成为有功能的蛋白。（3）近膜区的正电荷是小鼠corin蛋白在细胞膜锚定所必需的，且正电性越强越利于蛋白在细胞膜上表达。我们的工作对氨基末端序列在corin细胞膜表达及活化中的作用有了新的认识，从而揭示corin蛋白在胞内合成运输过程中相关的分子机制，同时我们的研究也为其它跨膜丝氨酸蛋白酶细胞膜锚定及酶原活化机制提供一定的理论基础。
【作者】李慧；
【导师】吴庆宇；
【作者基本信息】苏州大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】细胞膜锚定；Corin；胞内段；利钠肽；蛋白酶；突变；

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