斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）NF-κB信号通路相关基因的分子克隆及其功能初步研究

【摘要】石斑鱼是我国以及东南亚各国重要的海水养殖鱼类,经济价值极高。随着石斑鱼养殖密度的增加以及海水养殖环境的不断恶化,各种疾病的爆发对石斑鱼养殖业造成了巨大的经济损失。新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus,SGIV)是从养殖患病石斑鱼中分离到的一种高致病性病毒病原,可导致石斑鱼死亡率达90%以上。NF-κB信号转导通路参与调节机体免疫和发育的多种生理活动,是联系机体天然免疫系统和特异性免疫系统的纽带。本研究以斜带石斑鱼为对象,成功克隆鉴定了三个与NF-κB信号转导相关的基因,分别编码石斑鱼NF-κB因子抑制蛋白IκBα两种亚型(命名为EcIκBαA和EcIκBαB)和抑制蛋白1κB激酶IKKα(命名为EcIKKα)。在此基础上,本文进一步分析了IκBα的两种亚型在SGIV感染中的功能,为探索鱼NF-κB信号通路的免疫调节功能奠定了理论基础。EcIκBαA和EcIκBαB分别编码308和318个氨基酸,其中EcIκBαA和EcIκBαB与斑马鱼的IκBαA和IκBαB分别有59%和53%的同源性。氨基酸序列比对分析结果表明,EcIκBαA和EcIκBαB在N端都含有一个保守的降解序列DSGLDS,在C端都含有一个PEST序列。不同的是,EcIκBαA含有5个ANK重复序列,而EcIκBαB含有6个ANK重复序列。对EcIκBαA和EcIκBαB的基因组序列分析显示,两者都含有6个外显子和5个内含子。基因表达分布显示：EcIκBαA和EcIκBαB在组织中分布广泛,且在免疫相关组织中分布较多。LPS、SGIV和溶藻弧菌刺激鱼体均能诱导EcIκBαA和EcIκBαB基因的表达,表达水平在12小时内达到峰值。亚细胞定位结果显示：EcIκBαA呈全细胞分布,而EcIκBαB主要分布在细胞质中,推测两者的功能存在一定的差异。双荧光素酶报告基因实验结果表明：过表达EcIκBαA和EcIκBαB均能抑制石斑鱼NF-κB因子p65和c-Rel的活性,EcIκBαA的抑制作用强于EcIκBαB,且两者抑制效果具有质粒转染剂量的依赖性,说明EcIκBαA和EcIκBαB可能是石斑鱼NF-κB信号通路的天然抑制剂。此外,过表达EcIκBαA能抑制SGIVORF019,ORF162和ORF072(MCP)基因的表达,推测EcIκBα可能在宿主抗病免疫反应中起重要作用。石斑鱼11(B激酶基因EcIκBα编码735个氨基酸,蛋白分子量大小为80.85kDa,PI为6.74。氨基酸序列分析发现EcIKKα含有一个激酶结构域(S_TKc)和一个IKKβNEMO结合域。该基因和其他已知物种的IKKα基因序列高度同源,与罗非鱼的相似性高达90%,与氏朴丽鱼的相似性高达89%。EcIKKα在组织中分布广泛,且在免疫相关组织中的分布较多。polI:C刺激后不能诱导EcIKKα表达量上调,推测EcIKKα在机体内是一种组成型基因,也暗示EcIKKα发挥功能并不是依靠提高其在机体的表达量实现。本文研究结果表明,石斑鱼的NF-κB存在多种调控因子,其重要的调控因子IκBα存在不同的类型,它们在抵御病毒感染中可能发挥着不同的功能,而NF-κB抑制蛋白激酶IKKα也可能参与宿主NF-κB信号通路对病原微生物的免疫调控作用,这不仅在一定程度上丰富了鱼类免疫学,也为制定鱼类病毒病防控策略提供了一定的理论依据。
【作者】高任；
【导师】秦启伟；周永灿；
【作者基本信息】海南大学，水产养殖学，2014，硕士
【关键词】斜带石斑鱼；EcIκBαA和EcIκBαB；EcIKKα；NF-κB信号通路；SGIV；

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