工程噬菌体的构建及其检测大肠杆菌O157：H7的初步研究

【摘要】本研究依托国家质检总局科技课题《应用工程噬菌体检测大肠杆菌O157的研究》(2012IK163)。自从E.coliO157:H7在上世纪八十年代被发现以来，因致病性强已被世界卫生组织列为严重威胁公共安全的食源性致病菌之一。在欧美等发达国家曾出现过多次因食用被污染的食物而中毒死亡的案例，在我国疫情也时有发生。如何才能快速高效的检测食品或食品原料中的E.coliO157:H7，避免食品安全事故发生已成为世界各国卫生部门共同关注的焦点。噬菌体是细菌病毒，能特异性的侵染其宿主菌。可以利用噬菌体和细菌之间的这种特异性关系开发出以噬菌体为基础的检测方法。噬菌体法检测食源性致病菌以其特异性强、检测时间短、成本低等优点已受到越来越多的重视，能成为现有检测方法的补充或替代。本研究以E.coliO157:H7为宿主菌，从长春市一处污水处理厂分离出一株噬菌体JL1，用24株不同的菌种研究其宿主谱表明JL1是窄谱噬菌体，对E.coliO157:H7具有专一性。研究JL1生物学特性，以处理后的噬菌体效价为指示指标，研究pH、温度、氯仿等对其活性的影响；绘制噬菌体一步生长曲线，JL1潜伏期为20min，裂解期为30min；用透射电镜观察噬菌体形态并对其进行分类，JL1属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科，头部呈正二十面体，直径约为30±2nm，尾部长而柔软，长度约为110±10nm。提取JL1DNA后对其进行全基因组测序，JL1为双链DNA，全长为43,457bp。分析JL1开放阅读框(ORF)、假定基因并对其进行注释，共找到240个大于100bp的开放阅读框，60个假定基因(putativegene)，其中19个基因编码的蛋白可以被指定相应功能，39个能找到同源性较高但功能未知的序列，是保守假定蛋白基因，有2个没有找到同源性序列，是假定蛋白基因。噬菌体JL1全基因组已提交到GenBank，编号为JX865427.2。用WebACT分析JL1与4株序列相似度高的噬菌体基因组，结果显示JL1的基因结构和排列与它们有较大的区别，又和8种以E.coliO157:H7为宿主菌的噬菌体基因组相比较，基因组大小、GC含量、基因密度等有着明显的差别，JL1为一株新的E.coliO157:H7专一性噬菌体。分析JL1基因结构，选定3个可能为衣壳蛋白的基因，用同源重组法将绿色荧光蛋白报告基因插入它们的3’端区域，构建报告噬菌体。成功筛选到一株重组成功的噬菌体JL1-EGFP。用JL1-EGFP检测E.coliO157:H7纯培养物，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，能检出阳性的最低浓度为104CFU/mL。鉴定重组后噬菌体的宿主谱，JL1-EGFP对E.coliO157:H7具有专一性。
【作者】吴涵；
【导师】潘风光；
【作者基本信息】吉林大学，食品科学，2014，硕士
【关键词】噬菌体；大肠杆菌O157:H7；生物信息学分析；报告噬菌体；

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