牛Myostatin前导肽突变对肌肉增殖能力的影响

【摘要】目前，牛肉已经成为人们餐桌上最重要的肉类食品之一，随着近几年来生活水平的提高，人们对食品安全和肉类的质量更加重视，提高牛肌肉质量是目前我们面临的一项重要课题。以往的研究表明，小鼠的骨骼肌中存在一个与肌肉增殖相关的因子，即肌肉生长抑制素。当MSTN基因缺失时，骨骼肌重量将大幅度增加。MSTN基因对肌纤维的增粗增大可以产生抑制作用，其前两个外显子共同编码N端前肽，第三外显子编码C端多肽。突变牛MSTN基因成熟肽编码区会导致其功能失活，而前导肽编码区突变会引起其结构发生改变，导致前导肽与成熟肽的结合更紧密，从而对MSTN基因功能的发挥产生抑制作用。本研究以bMSTN基因为研究对象，对bMSTN基因编码区E1-224-A>C突变前后的基本信息及结构的变化进行对比分析；同时，在bMSTN基因编码区引入A224C和G938A点突变，并成功构建了pEF1a-IRES-DsRed-Express2-bMSTN-mut真核表达载体，转染牛成肌细胞后，对bMSTN-mut及与细胞周期相关的P21和CDK2基因的表达水平进行了测定，最终，对细胞周期的变化进行了检测；之后，利用bMSTN-mut基因免疫小鼠，检测了bMSTN-mut基因对小鼠肌肉增殖能力及繁殖性能的影响。得到如下主要结果：（1）通过巢式PCR法扩增了bMSTN基因编码区，用生物信息学方法对bMSTN基因编码区E1-224-A>C突变前后的基本信息及结构的变化进行对比分析。ProtParam软件对突变前后bMSTN基因基本信息分析结果表明，其原子组成、原子个数、分子质量、等电点、酸性氨基酸个数、疏水性氨基酸个数和负电荷残基个数均发生了改变；利用NEBcutterV2.0、SingnalP、TMpred和TMHMM、TargetP1.1、WOLFPSORT和ProtCompV9.0等在线工具对突变前后bMSTN基因的内切图谱变化、码蛋白的跨膜结构、编码蛋白质亚细胞定位等进行分析和预测发现，突变前后bMSTN基因以上各项均未发生改变；利用SOPMA对bMSTN突变前后编码蛋白的二级结构进行分析，结果显示，各元件的分布位置发生了改变，突变型bMSTN基因编码蛋白二级结构α螺旋增加了1.87%、伸展条增加了0.54%、β转角减少了0.8%、无规则卷曲减少了1.6%；最后，利用Phyre2服务器分别对突变前后bMSTN基因编码蛋白三级结构进行建模表明，突变的bMSTN基因编码蛋白的空间构型相对稳定，即突变的bMSTN基因编码的前导肽与成熟肽空间构象结合更紧密，且拉氏图结果支持了模拟结果的可靠性。（2）通过融合PCR法成功的引入A224C和G938A突变位点。在此基础上，我们构建了突变的bMSTN基因真核表达载体，转染牛成肌细胞后，利用qPCR和Westernblot法从RNA及蛋白水平上检测了bMSTN-mut和与细胞周期相关的P21、CDK2等基因的表达，结果表明，在牛成肌细胞中，突变的bMSTN基因可以下调P21表达水平、上调CDK2的表达水平，最终促进细胞增殖。（3）利用电脉冲介导法将重组质粒免疫小鼠，注射部位为后腿右侧股四头肌。通过不同时期ELISA检测结果我们可以发现，实验组小鼠的生长激素及甘油三酯水平呈上升趋势，且最终高于对照组和PBS组，实验组小鼠的MSTN抗体水平呈下降趋势，但三次检测均高于对照组和PBS组；对不同时期小鼠体重增长分析得出，在5周龄和9周龄时，实验组体重显著增加（p＜0.05），其余各时期，各组之间差异不显著（p＞0.05）；从增长速率来看，在5周龄和9周龄时，实验组显著增加（p＜0.05），在6周龄和7周龄时，实验组显著减少（p＜0.05），其余各时期，各组之间差异不显著（p＞0.05）；实验组、对照组及PBS组的左右大腿腿长、腿宽、腿重以及股四头肌重量差异均不显著（p＞0.05），进一步对比分析得出，实验组右腿综合增长趋势高于左腿，且增长水平均高于对照组和PBS组；对小鼠股四头肌肌纤维进行检测可得出，基因免疫小鼠的股四头肌肌纤维数目增多、肌纤维增粗；对小鼠产仔数、平均初生重、断奶重进行检测的结果显示，bMSTN-mut基因免疫小鼠后，实验组小鼠的产仔数低于对照组和PBS组，但差异不显著（p＞0.05），实验组仔鼠的平均初生重与对照组和PBS组相比升高，但差异不显著（p＞0.05），实验组仔鼠断奶重显著高于对照组和PBS组个体（p＜0.05）。综上，bMSTN-mut基因可以在细胞及动物机体内表达，最终可以促进肌肉的增殖。以上研究结果为进一步探索bMSTN基因在骨骼肌生长发育调控中的作用机制提供了依据，对改善肉牛肉质和提高生产性能具有重要的意义。
【作者】高峰；
【导师】邢沈阳；
【作者基本信息】吉林大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】牛；MSTN基因；定点突变；细胞增殖；基因免疫；

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