鸡TLR7靶向miRNA的预测及鉴定

【摘要】TOLL样受体是天然免疫中重要的模式识别受体，TLR7做为天然免疫中抗病毒反应的主要反应受体之一，TLR7介导的抗病毒免疫通路一直是最新研究的热点。而miRNA做为一种重要的转录后基因调控机制，广泛参与了宿主的各种生命过程。为了解在流感病毒入侵机体后miRNA是否调控了天然免疫中TLR7的表达，本研究首先通过研究禽流感感染鸡和SPF鸡的TLR7基因mRNA的表达量差异，证明了TLR7基因参与了抗病毒的天然免疫机制，并预测miRNA在病毒感染鸡的免疫系统时，某些miRNA对TLR7的表达起到了调控作用。利用生物信息学方法预测调控TLR7的miRNA为miR107-3p和miR27b-3p，为了验证此结果，构建双荧光素酶报告基因系统来鉴定miR107-3p和miR27b-3p与TLR7的靶标关系。所得实验结果为：（1）在禽流感感染鸡和SPF鸡中TLR7基因均有表达，且禽流感感染鸡中的TLR7基因mRNA的表达量明显增高。在对禽流感感染鸡和SPF鸡中TLR7的基因定量结果显示，在免疫器官中，脾脏中TLR7基因的mRNA表达量上调1.70倍，在法氏囊中上调1.65倍，在胸腺中上调6.70倍，而在病变器官中，肺脏中TLR7mRNA表达量上调4.70倍，气管上部中上调1.60倍。气管下部中上调1.80倍，差异显著（P<0.05）。（2）通过3`RACE成功获得鸡TLR73`UTR序列，并通过生物信息学分析，预测得到3`UTR序列上miRNA可能的作用靶点。（3）通过miRanda、RITA软件和Targetscan网站成功预测TLR7的靶向miRNA。在TLR7的3`UTR序列上存在着miR107-3p、miR27b-3p的作用靶点，而RNA芯片结果和TLR7定量结果也显示这两个miRNA可能与TLR7存在调控关系。（4）成功构建了miR107-3p、miR27b-3p的WT（野生型）、Mut（突变型）的双荧光素酶报告载体。（5）优化了mimics（miRNA模拟物）与重组质粒载体共转染的条件。（6）野生型（WT）和突变型(Mut)双荧光素酶报告载体与mimics（miRNA模拟物）共转染后，差异极显著(P<0.01)，即野生型(WT)的荧光值远小于突变型（mut），说明miRNA调控了TLR7的表达。本研究通过研究禽流感感染鸡和SPF鸡中TLR7基因mRNA的表达量差异，验证了TLR7参与家禽在流感病毒入侵的免疫机制，又成功通过生物信息学分析和预测，得到了调控TLR7基因的miRNA，并进一步通过双荧光素酶报告基因系统检测和鉴定miRNA对TLR7的调控。本研究为进一步了解病毒入侵机体时天然免疫中的信号通路和miRNA在天然免疫系统中的调控机制提供了重要参考，并为研究TLR7在禽流感感染家禽的天然免疫过程中所起到的作用奠定了基础。
【作者】郭将；
【导师】赵志辉；
【作者基本信息】吉林大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】TLR7禽流感；miRNA；双荧光素酶报告基因；天然免疫；

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