吸入一氧化氮诱导内皮祖细胞归巢防治支气管肺发育不良的研究

【摘要】前言支气管肺发育不良(Bronchopulmonarydysplasia,BPD)是严重威胁小早产儿长期存活和生存质量的一种慢性肺病。BPD发生的病理改变主要是肺泡简化和肺血管异常。促进受损肺血管的修复是BPD防治的新思路。内皮祖细胞(EpithelialProgenitorCells,EPCs)是一类具有自我更新和高度增殖能力的血管内皮前体细胞。骨髓是多种干/祖细胞的重要储存池。EPCs的归巢(homing)是指在某些生理或病理因素刺激下,骨髓内EPCs动员进入血循环,动员的骨髓EPCs或者移植的EPCs在归巢因子的作用下归巢至外周微血管系统,参与血管的生成和修复。研究显示循环EPCs的数量和功能障碍与BPD的发生有一定的相关性。EPCs用于修复缺血部位的血管的治疗策略在临床上已经得到初步尝试,主要集中于心血管领域。吸入一氧化氮(NitricOxide,NO)能降低小早产儿BPD的发生率,但是单一治疗疗效有限。动物研究显示,吸入NO能促进骨髓EPCs动员至肺,参与急性肺损伤的修复。以上研究启发了我们这样一个假设,吸入NO能否诱导移植EPCs归巢至肺参与BPD血管损伤的修复。本研究围绕这样一个假设,第一部分开展eNOS/NO信号对EPCs归巢功能的体外研究,第二部分建立大鼠BPD模型,研究外源性静脉输入EPCs同时吸入NO诱导移植EPCs归巢能否达到防治BPD的协同作用,并对其机制进行研究。希望通过我们的研究能够为将来临床移植EPCs同时吸入NO的协同治疗BPD提供些许思路。第一部分eNOS/NO信号对EPCs归巢生物学功能影响的体外研究背景：EPCs是一类能循环、增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成血管的前体细胞。EPCs具有趋向性,在血管损伤发生后,在细胞因子的作用下,EPCs能够动员并归巢至血管损伤部分,参与损伤的内皮细胞增殖和修复。表达内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)是EPCs的一个重要特征。eNOS可以利用L-Arg、氧气和辅因子产生NO。eNOS/NO是骨髓EPCs动员的重要信号。eNOS/NO信号在EPCs归巢中的作用还不完全明了。N(1)-硝-L-精氨酸甲酯(N^-nitro-L-argininemethylester,L-NAME)是eNOS非特异性的抑制剂,可以竞争性抑制eNOS活性,减少NO生成。目的：分离、纯化、培养和鉴定大鼠骨髓来源的EPCs。观察抑制eNOS活性对体外培养的大鼠骨髓源性EPCs迁移、增殖、管腔形成等归巢生物学活性的影响,并初步探讨其作用机制。方法：分离大鼠股、胫骨骨髓中单个核细胞,结合纤连蛋白贴壁筛选法培养细胞,培养7-10天。荧光显微镜检测培养所得细胞结合FITC-UEA-1和摄取Dil-ac-LDL的内皮功能能力,采用流式细胞学方法检测培养所得细胞CD34+比例。用L-NAME抑制培养所得细胞的eNOS活性后,采用细胞培养小室迁移系统、Matrigel体外管腔形成体系、增殖细胞的体外标记结合流式细胞学方法检测培养所得细胞的迁移、血管样结构形成和增殖情况。采用实时荧光定量PCR的方法和Westernblot的方法检测CXCR4、CXCR7、VEGFR2和eNOSmRNA和蛋白表达水平。采用硝酸还原酶法检测细胞分泌NO的水平。结果：分离所得细胞培养至第5天出现集落样改变,培养7-10天出现典型的梭形、双针样改变,细胞融合度达到80%左右；FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL双染细胞约85%左右；培养所得细胞CD34+细胞在68.2-72.4%之间。抑制eNOS活性后,细胞迁移能力、增殖情况和管腔形成能力均显著小于对照组(P<0.05)。抑制eNOS活性后,mRNA和蛋白水平上细胞表达CXCR4和eNOS均显著小于对照组(P<0.05),而CXCR7和VEGFR2的1nRNA和蛋白表达受抑制不明显。抑制‘;NOS活性后,细胞分泌NO的水平显著小于对照组(P<0.05)。结论：成功分离和纯化大鼠骨髓来源的EPCs。eNOS抑制齐L-NAME显著降低骨髓来源EPCs表达eNOS,减少NO生成。eNOS/NO对EPCs的迁移、增殖和体外管腔形成有调节作用,对EPCs归巢分子CXCR4的表达有调节作用。第二部分吸入NO诱导EPCs归巢防治新生大鼠BPD的研究背景：BPD的发生是多因素的,其防治策略也包括多个方面,吸入NO和干细胞治疗尚处于探索阶段。吸入NO在临床儿科主要用于新生儿低氧性呼吸衰竭和持续性肺动脉高压,在BPD的防治疗效中作用有限。动物实验的结果显示移植EPCs至肺循环中,可以改善肺血管和肺泡的发育。有研究显示吸入NO能动员早产猪骨髓EPCs、增加骨髓源性EPCs在肺内定植、减轻肺血管损伤、促进肺修复。急性肺损伤和BPD的发生在临床上有一定的相关性和连续性,那么在BPD的防治策略上,能否将吸入NO和移植EPCs结合起来从而达到协同防治的目的。本部分通过动物研究,探讨吸入NO诱导移植EPCs归巢至肺对BPD模型的防治作用,并探讨其机制,为临床治疗BPD提供一些思路。目的：建立新生大鼠的BPD模型。研究移植EPCs同时吸入NO对BPD的防治作用,探讨吸入NO诱导移植EPCs归巢至肺的机制。方法：将新生大鼠暴露于85%高氧中28天建立大鼠BPD模型。采用BrdU体外标记培养的EPCs,通过大鼠尾静脉注射至体循环的方法移植EPCs。实验分为6组,每组15只。空气组(C组)：空气中饲养28天。单纯高氧组(O组)：85%高氧暴露28天。高氧+EPCs移植组(E组)：85%高氧暴露21天,第22天给予尾静脉注射EPCs1×105个,继续高氧暴露直至28天。高氧+EPCs+L-NAME组(L组)：85%高氧暴露21天,第22天给予尾静脉注射EPCs1×105个,同时腹腔注射L-NAME(20mg/kg/天),继续高氧暴露直至28天。高氧+EPCs+吸入NO组(N组)：85%高氧暴露21天,第22天给予尾静脉注射EPCs1×105个,同时吸入NO(5ppm,连续7天）,继续高氧暴露7天。高氧+EPCs+吸入NO+L-NAME组：85%高氧暴露21天,第22天给予尾静脉注射EPCs1×105个,吸入NO(5ppm,连续7天),同时给予腹腔注射L-NAME(20mg/kg/天),继续高氧暴露直至28天。实验期间每日定时更换饲料、垫料、交换母鼠,观察仔鼠生长情况和呼吸情况,对氧浓度、湿度和温度监测,实时监测吸入NO浓度。实验结束时留取外周血标本,采用流式细胞学方法检测循环CD34+细胞水平；采用ELISA方法检测血清VEGF的表达。自右心室冲洗肺循环后留取肺标本。取右肺上叶和中叶组织液氮保存,采用实时荧光定量的方法检测VEGF、VEGFR2、eNOS和SDF-1mRNA的表达。取右下叶液氮保存,采用Westernblot方法检测VEGF、VEGFR2和eNOS的表达。。取右肺副叶液氮罐中保存,采用硝酸还原酶法检测NO表达。左肺4%多聚甲醛固定,石蜡包埋后留做病理,HE染色分析肺的形态学改变,并进行辐射状肺泡计数：免疫酶组织化学方法检测肺内八因子的表达；免疫酶组织化学方法和荧光免疫组织化学方法观察移植EPCs在肺内的定植情况。结果：根据研究目的,将结果分成以下五部分来介绍。1、BPD模型的建立新生鼠吸入85%氧气2周后,毛发失去光泽,体重增加缓慢,脱氧后有明显呼吸急促表现,重新给氧后,呼吸困难可缓解,至实验结束时高氧暴露组仔鼠体重显著小于对照组。肺组织病理切片示：肺泡正常结构消失,肺泡腔直径扩大,肺泡数量减少,肺泡间隔增厚。正常组小鼠肺组织病理切片示：肺泡结构规整,肺泡大小均一,肺泡间隔较薄。2、吸入NO同时移植EPCs对BPD肺泡数目和肺血管的影响肺组织病理显示高氧干预各组肺泡腔直径明显扩大,肺泡数量减少,肺泡间隔增厚。辐射状肺泡计数(Radialalveolarcount,RAC)显示6组仔鼠RAC计数有显著差异。两两比较显示,空气对照组RAC数目显著高于其他各组；高氧+EPCs+吸入NO组RAC显著高于其他高氧干预组。肺组织八因子免疫组化显示C组、E组和N组的微血管密度分别高于O组、L组和S组。N组的微血管密度显著高于其他各组。3、吸入NO同时移植EPCs对循环CD34+细胞水平的影响各组仔鼠外周血CD34+细胞水平有显著差异。两两比较显示,对照组CD34+细胞水平显著高于O、E、L和S组；外源性输入EPCs组(E组、N组)的CD34+细胞水平显著高于高氧组和加用NO抑制剂组(L组和S组)；N组CD34+细胞水平显著高于其他各组。给予EPCs同时加用eNOS抑制剂组CD34+细胞水平(L组)与单纯高氧组无显著差异,而在给予NO吸入后(S组)可显著提高CD34+细胞水平。4、移植EPCs在肺内的定植情况移植EPCs能够定植于肺组织中,N组EPCsJ肺内定植高于其他各组,E组肺内定植的EPC高于L组。5、吸入NO同时移植EPCs对归巢分子表达的影响(VEGF/VEGFR2、eNOS、SDF-1、NO)(1)血清VEGF水平的变化各组血清VEGF水平存在显著差异。EPCs干预组(E组、L组、N组和S组)的血清VEGF水平显著高于非EPC干预组(C组和O组)。对照组血清VEGF水平较高氧干预组有增高趋势。(2)mRNA水平上VEGF/VEGFR2、eNOS、SDF-1的表达。各组间VEGFmRNA的表达量有显著差异。高氧干预各组(O组、E组、L组、N组和S组)的VEGFmRNA的表达量较空气对照组显著减少。E组VEGFmRNA水平显著高于L组和S组；与N组相比,无统计学差异。各组间VEGFR2mRNA的表达量有显著差异。高氧干预各组(O组、E组、L组、N组和S组)的VEGFR2mRNA的表达量较空气对照组显著减少。O组、E组、L组、N组和S组的VEGFR2mRNA的表达量两两比较,无显著差异。各组间eNOSmRNA的表达量有显著差异。C组eNOSmRNA显著高于O组、L组和S组,而与E组和N组无显著差异。N组eNOS表达显著高于O组,有高于E组、L组和S组的趋势。各组间SDF-1mRNA的表达量无显著差异。(3)蛋白水平上VEGF/VEGFR2和leNOS表达各组间VEGF表达量有显著差异。两两比较发现,C组和N组VEGF蛋白表达显著高于其他4组。C组和N组两组比较无显著差异。O组、E组、L组和S组VEGF表达无显著差异。各组间VEGFR2表达量统计学上无显著差异。肺组织各组间eNOS表达量有显著差异；EPCs干预各组(E组、L组、N组和S组)eNOS表达量显著大于C组和O组；EPCs干预各组间两两比较,eNOS表达量无显著差异。(4)NO水平的表达各组NO表达水平无显著差异。结论：吸入NO同时移植EPCs可改善BPD的肺泡化和血管形成。吸入NO可诱导移植EPCs归巢至肺,主要是通过局部VEGF和eNOS途径介导的。
【作者】陆爱珍；
【导师】孙波；
【作者基本信息】复旦大学，儿科学，2013，博士
【关键词】内皮祖细胞；内皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；支气管肺发育不良；肺损伤修复；

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