猪BCL-G促凋亡作用及其与JAB1或MELK的相互作用

【摘要】细胞凋亡是细胞发生程序性死亡的过程，在正常生理和病理条件下都非常重要。细胞凋亡最重要的信号通路有两条，即外源性和内源性细胞凋亡途径。BCL-2基因家族是一类调节内源性细胞凋亡途径的关键基因。BCL-G基因是BCL-2基因家族的重要成员之一，参与人类系统性红斑狼疮、乳腺癌和前列腺癌等疾病的发生过程，近年来在人类和小鼠等物种被广泛研究。然而，猪BCL-G（pBCL-G）基因的功能迄今没有研究报道。猪是一种比小鼠更理想的医学实验动物模型，对pBCL-G基因的研究将推动人类BCL-G基因及其相关疾病的研究。本论文以pBCL-G基因的功能研究为主线，围绕其组织表达分布、亚细胞定位，与猪JAB1（pJAB1）和MELK（pMELK）等基因的相互作用，以及其对细胞凋亡的促进作用展开深入研究。获得研究结果如下：1.实时荧光定量PCR检测发现，pBCL-G在转录水平上广泛表达于多种组织，但各种组织的表达情况不尽相同。心脏组织表达量最高，肾脏组织表达量最低，两者表达量相差6倍左右。在腹浅淋巴结、肺门淋巴结、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结和脾脏等组织有中等表达量，其它组织的pBCL-G表达水平都较低。2.通过表达绿色荧光蛋白（GFP）融合的关键结构域缺失pBCL-G蛋白和激光共聚焦显微镜观察发现，完整的pBCL-G蛋白亚细胞定位为细胞质和细胞核均有分布；当BH2结构域缺失时，pBCL-G蛋白的亚细胞定位变成呈点状分布于细胞质；当BH3结构域缺失时，pBCL-G蛋白的亚细胞定位并没有受到影响，与完整pBCL-G蛋白定位一致。3.通过瞬时转染和新霉素（G418）筛选获得稳定表达GFP-pBCL-G和GFP蛋白的猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）各一株。通过倒置荧光显微镜观察，在传代的两株细胞中均能检测到90%以上的荧光信号，而且通过westernblot分析能在两株细胞中分别检测到GFP-pBCL-G和GFP蛋白的表达。4.在光学显微镜下观察发现，与对照组细胞相比，用聚肌胞（polyI:C）或星孢菌素（STS）诱导处理的瞬时表达GFP-pBCL-G蛋白的细胞出现皱缩、变圆、脱落，体积变小、变形，细胞膜出现发泡现象等细胞凋亡的特征。将细胞用Hoechst33342染色后，在倒置荧光显微镜下观察发现，对照组细胞核被染成均一的淡蓝色，核完整性良好，而polyI:C或STS处理后部分细胞发生染色质凝聚、核固缩等细胞凋亡的典型特征，细胞核内呈现亮蓝色荧光。将瞬时表达GFP-pBCL-G或GFP蛋白的细胞用AnnexinV-PE与7-AAD进行双重染色，结合流式细胞术分析表明，pBCL-G蛋白对polyI:C或STS诱导的细胞凋亡具有显著的促进作用。5.通过反转录PCR克隆得到pJAB1基因，共包含8个外显子，编码334个氨基酸。生物信息学分析表明，JAB1蛋白在生物进化上高度保守。组织表达分析表明，在转录水平上，pJAB1基因与pBCL-G基因一样均在心脏表达量最高。免疫共沉淀实验表明，pBCL-G与pJAB1或pMELK蛋白均能够发生相互作用，而且pBCL-G与pMELK蛋白相互作用后，使得pMELK蛋白发生特异性降解。此外，当pBCL-G与pJAB1或pMELK蛋白共表达时，pJAB1或pMELK蛋白均能影响pBCL-G蛋白的亚细胞定位。6.用AnnexinV-PE与7-AAD进行双重染色结合流式细胞术分析表明，稳定表达的pBCL-G蛋白对STS诱导的细胞凋亡具有显著的促进作用；瞬时表达的pJAB1蛋白对STS诱导的细胞凋亡也具有显著的促进作用；pBCL-G与pJAB1蛋白共表达能够协同促进STS诱导的细胞凋亡。经caspase蛋白活性检测和westernblot检测发现，过表达pBCL-G蛋白的细胞在STS诱导下发生细胞凋亡过程中，caspase-8、caspase-9和caspase-3都发生了活化，而且与对照组的细胞相比，三种蛋白的活化程度都有显著性提高；过表达pJAB1蛋白的细胞在STS诱导下发生细胞凋亡过程中，只有caspase-9和caspase-3发生了活化，而且与对照组的细胞相比，两种蛋白的活化程度也显著性提高。综上所述，本论文首次通过实验明确了pBCL-G基因的组织表达分布，分析了影响其亚细胞定位的关键结构域，发现了pBCL-G蛋白对polyI:C或STS诱导的细胞凋亡的促进作用，确定了pBCL-G与pJAB1或pMELK蛋白的相互作用，阐明了pBCL-G与pJAB1蛋白对STS诱导的细胞凋亡的协同促进作用，并初步探索了pBCL-G和pJAB1促进STS诱导的细胞凋亡的作用机制。
【作者】蒋朋飞；
【导师】张德礼；
【作者基本信息】西北农林科技大学，动物生物技术，2014，博士
【关键词】猪BCL-G基因；组织表达分布；亚细胞定位；蛋白-蛋白相互作用；细胞凋亡；

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