亚洲玉米螟中肠类钙粘蛋白和碱性磷酸酯酶与Cry1Ac抗性产生关系的研究

亚洲玉米螟中肠类钙粘蛋白和碱性磷酸酯酶与Cry1Ac抗性产生关系的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-10-25 分类:参考文献 喜欢:1805
师大云端图书馆

【摘要】亚洲玉米螟是我国主要的玉米害虫,表达BtCry毒素的转基因玉米为其防治提供了新的途径。近年来已有关于鳞翅目害虫对转Bt玉米产生抗性的报道,而本实验室亦证实通过Cry1Ab、Cry1Ac持续汰选,可以获得亚洲玉米螟抗性种群,这些现象都说明亚洲玉米螟具备对Cry毒素产生抗性的可能性,而害虫对Cry毒素产生抗性将成为威胁该技术长期使用的主要原因。“多基因”策略是延缓抗性产生的重要途径之一,而研究不同Cry毒素在昆虫中肠上的受体则是该策略的基础。研究受体与抗性产生的关系,将为抗性监测和治理提供重要的科学依据。本文在实验室已克隆亚洲玉米螟中肠类钙粘蛋白(ofCAD)的基础上,进一步克隆了另一个Cry1Ac受体碱性磷酸酯酶(ofALP),并且从转录水平调节及突变2个方便研究了上述2个受体与Cry1Ac抗性产生的关系,得到以下主要结果。通过原核表达和配体杂交技术将Cry1Ab/Cry1Ac在类钙粘蛋白上的结合区域定位在1347~1562位氨基酸的肽段上,该肽段位于ofCAD序列的近膜区(MPR);通过高压汰选,得到具有较高抗性的Cry1Ac抗性个体,在抗性个体中首次发现了3个MPR的突变体,即有2-3个氨基酸替换突变的MPR1-r1和MPR-r3,以及既有氨基酸替换突变又有一个26个氨基酸缺失突变的MPR-r2,且1458T→S在3个突变中均发生。成功原核表达MPR-r2,利用免疫共沉淀的方法及与MPR多肽片段进行比较,明确了MPR-r2突变体与Cry1Ac的结合能力下降。通过与亚致死量的Cry1Ac毒素进行混合后饲喂敏感品系的亚洲玉米螟幼虫,发现MPR多肽片段存在增效作用,而在突变体中则丧失这一现象;通过荧光定量PCR,发现在Cry1Ac抗性品系幼虫中,钙粘蛋白的转录水平在1、2、4龄发生显著下调。通过RACE技术克隆了亚洲玉米螟敏感品系的碱性磷酸酶基因ofalp;通过免疫荧光技术明确了其主要分布在中肠后半部分上皮细胞的顶部、基部及细胞侧板;通过免疫共沉淀技术首次证实ofALP是Cry1Ac结合受体;该结合可以被GalNAc解离;原核表达的ofALP的Cry1Ac结合区域多肽片段具备与Cry1Ac结合的能力并且可以对毒素起到增效作用;通过荧光定量PCR技术比较未发现ofALP的转录水平在抗、敏感品系亚洲玉米螟中具有显著差异。本研究结果初步表明,亚洲玉米螟类钙粘蛋白的表达水平、MPR区域突变尤其是缺失突变可能是其对Cry1Ac毒素产生抗性的原因,为今后检测亚洲玉米螟田间种群抗性个体的分子标记提供了参考。ofALP是亚洲玉米螟幼虫中肠上Cry1Ac毒素的受体,未发现其表达量与抗性有显著的关系。
【作者】靳婷婷;
【导师】何康来;
【作者基本信息】中国农业科学院,农业昆虫与害虫防治,2014,博士
【关键词】亚洲玉米螟;类钙粘蛋白;碱性磷酸酯酶;Cry1Ac毒素;靶标害虫抗性;

【参考文献】
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