烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和XIAP基因对新生大鼠耳蜗锰毒性保护作用的研究

【摘要】目的：(1)通过构建锰(manganese,Mn)的耳毒性动物模型,观察氯化锰(manganesechloride,MnCl2)对离体培养的新生大鼠耳蜗组织的毒性作用及其剂量反应关系。(2)评估烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide,NAD)治疗Mn耳毒性的有效性,观察MnCl2所致的耳蜗细胞凋亡情况及NAD在抗细胞凋亡中的作用。(3)评估携带XIAP基因(X-linkedinhibitorofapoptosisprotein,凋亡抑制蛋白家族的成员之一)的改良型纳米羟基磷灰石载体复合物(PEG-PEI-nHAT-pEGFPN1-XIAP)治疗Mn耳毒性的安全性和有效性。方法：(1)采用出生后第3天的SASCO-SD大鼠作为本实验研究对象,处死后小心分离其耳蜗组织,培养过夜后,实验组以MnCl2浓度分别为0.5mM、1.0mM口3.0mM的培养液培养48h,对照组则以不含MnCl2的培养液培养。免疫荧光染色后于激光共聚焦倒置荧光显微镜下观察各组病理改变,并绘制耳蜗图。(2)采用上述大鼠,经解剖分离、培养过夜后,对照组以仅含0.5-3.0mMMnCl2的培养液处理,实验组以含0.5-30mMMnCl2和20mMNAD的培养液处理,空白对照组以不含MnCl2和NAD的培养液处理,均培养48h。免疫荧光染色后于激光共聚焦倒置荧光显微镜下观察各组病理改变,并绘制耳蜗图。对耳蜗基底膜单位长度内各组存活的听神经纤维(auditorynervefiber,ANF)和耳蜗神经节单位体积内存活的螺旋神经节细胞(spiralganglionneuron,SGN)进行计数和统计学分析。(3)采用上述大鼠,经解剖分离、培养过夜后,对照组以仅含1.0mMMnC12的培养液处理,实验组以含1.0mMMnCl2和20mMNAD的培养液处理,空白对照组以不含MnCl2和NAD的培养液处理,各组培养6h后用于caspase染色,培养9h后用于TUNEL染色。于激光共聚焦倒置荧光显微镜下观察各组TUNEL和caspase染色的情况。对单位体积内凋亡细胞标记阳性的SGN及存活的SGN进行计数和统计学分析。(4)采用化学共沉淀—水热合成法制备改良型纳米羟基磷灰石载体(PEG-PEI-nHAT),并与治疗基因XIAP结合,制备纳米基因载体复合物PEG-PEI-nHAT-pEGFPNl-XIAP。对纳米基因载体复合物的安全性进行评估时,对照组以不含PEG-PEI-nHAT-pEGFPN1-XIAP的培养液处理,实验组以含500μ1浓度为1μg/μl的PEG-PEI-nHAT-pEGFPN1-XIAP的培养液处理；进行有效性评估时,对照组以仅含0.5～3.0mMMnCl2的培养液处理,实验组以含0.5-3.0mMMnCl2加500μ1浓度为1gg/μl的PEG-PEI-nHAT-pEGFPN1-XIAP的培养液处理,均培养48h。于激光共聚焦倒置荧光显微镜下观察各组SGN的存活情况,对单位体积内存活的SGN进行计数和统计学分析。结果：(1)对照组中耳蜗组织内、外毛细胞排列整齐有序,未见损伤或缺失,ANF由SGN发出,向毛细胞(haircell,HC)呈放射状分布,排列平整,密集成束,SGN具有大而圆的胞体。MnCl2处理组(0.5-30mMMnCl2处理48h)中,随MnCl2浓度增高,HC、ANF和SGN的密度不断降低,HC的表皮板和静纤毛中的肌动蛋白也有所减少,ANF开始呈稀薄泡状,SGN胞体收缩碎裂,呈现凋亡细胞的特征。耳蜗图显示,随MnCl2浓度增高,HC缺失比例从20%逐渐升至70%。(2)NAD保护组(0.5-3.0mMMnCl2+20mMNAD处理48h)和MnCl2处理组(0.5-3.0mMMnCl2处理48h)相比,耳蜗组织的损伤得到了显著改善。在相应的MnCl：浓度下,加入20mMNAD后残存的ANF和SGN均有提高,由SGN辐射状向HC发出的ANF形态较完整,断裂成泡状的情况减少。同一MnCl2浓度下,NAD保护组中存活的ANF和SGN数均高于MnCl2处理组,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)空白对照组中,TUNEL染色阳性的SGN不明显；MnCl2处理组(1.0mMMnCl2处理9h)中,TUNEL染色阳性的SGN频繁可见；NAD保护组(1.0mMMnCl2+20mMNAD处理9h)中,TUNEL染色阳性的SGN相对于MnCl2处理组有所减少。MnCl2处理组(1.0mMMnCl2处理6h)中,较多的SGN被活化的caspase-3,-8,-9探针标记,尤其是胞体固缩、变形的SGN；NAD保护组(1.0mMMnCl2+20mMNAD处理6h)中,被活化的caspase-3,-8,-9探针标记的SGN明显少于MnCl2处理组。NAD保护组和MnCl2处理组中TUNEL和caspase染色呈阳性的细胞的比例差异均有统计学意义(p<0.05)。(4)纳米基因载体复合物的安全性评价中,对照组中正常的SGN数量多,其胞体大而圆；实验组(500μlPEG-PEI-nHAT-pEGFPN1-XIAP处理48h)中SGN无明显的固缩和破碎,胞体大而圆,XIAP基因的绿色荧光蛋白在SGN及周围细胞内有表达而呈绿色荧光；两组存活的SGN计数无统计学差异(p>0.05)。有效性评价中,随着MnCl2浓度上升,对照组(0.5-3.0mMMnCl2处理48h)中多数SGN胞体破碎、细胞核固缩、细胞严重缺失；实验组中(0.5-3.0mMMnCl2+500μlPEG-PEI-nHAT-pEGFPN1-XIAP处理48h),随着MnCl2浓度上升,SGN仍不可避免出现核固缩、破碎和细胞缺失,但严重程度低于对照组,且XIAP基因中的绿色荧光蛋白在SGN及周围细胞内有表达而呈绿色荧光；同一浓度下,实验组中存活的SGN数均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。提示XIAP基因对锰中毒导致的耳毒性损伤可能具有保护作用。结论：(1)Mn可引起SD大鼠耳蜗HC.ANF和SGN的病理损伤,毒性作用呈量效关系,病理损害程度随Mn浓度增加而增大。(2)NAD可减轻Mn对SD大鼠耳蜗ANF和SGN的损伤作用,在低浓度Mn条件下,NAD可减轻Mn对SD大鼠耳蜗HC的损伤作用。(3)Mn耳蜗毒性的病理生理学机制与caspase-3,-8,-9的活化、DNA碎裂以及细胞凋亡有关,NAD可抑制Mn诱导的caspase活化、DNA碎裂和细胞凋亡。(4)纳米基因载体复合物PEG-PEI-nHAT-pEGFPN1-XIAP对耳蜗SGN无明显急性毒性作用,XIAP基因对Mn所致的耳蜗SGN损伤可能具有保护作用。图22幅,表9个,参考文献182篇。
【作者】王璐；
【导师】孙虹；丁大连；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】锰；耳蜗；耳毒性；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；XIAP；纳米基因载体复合物；螺旋神经节细胞；毛细胞；细胞凋亡；

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