Ezrin蛋白在骨肉瘤侵袭转移中的作用及黄芩素对其表达的影响

【摘要】目的：探讨Ezrin蛋白在骨肉瘤组织中的表达及其与骨肉瘤临床病理特征的关系。方法：1.收集126例骨肉瘤组织石蜡标本及27例骨软骨瘤组织石蜡标本,通过免疫组化染色检测标本中Ezrin蛋白表达情况；2.分析骨肉瘤组织中Ezrin蛋白表达与患者性别、年龄以及肿瘤直径、病理分型、Ennecking分期、位置、肺部转移等临床病理特征的关系。结果：1.骨肉瘤组织中Ezrin蛋白阳性率(81.74%)明显高于骨软骨瘤组织(29.63%),差异有显著性(,=35.63,P<0.01)；2.伴有肺部转移的骨肉瘤组织中Ezrin蛋白阳性率(97.78%)较无肺部转移者(72.84%)增加,差异有显著性(x2=15.68,P<0.05),低分化骨肉瘤组织中Ezrin蛋白阳性率(94.87%)也高于中+高分化者(75.86%)(x2=12.32,P<0.05),但是在不同性别、年龄、肿瘤直径、Ennecking分期及部位的骨肉瘤组织中Ezrin蛋白阳性率并无显著性差异(均P>0.05)。结论：Ezrin蛋白在骨肉瘤组织中明显升高,且与肿瘤肺转移及恶性程度相关。图8幅,表2个,参考文献23篇。目的：应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性下调Ezrin蛋白在骨肉瘤MG-63细胞中的表达,探讨Ezrin蛋白在骨肉瘤侵袭、转移中的作用。方法：1.设计3对EzrinsiRNA(EzrinsiRNA1、EzrinsiRNA2、EzrinsiRNA3),转染MG-63细胞,采用荧光实时定量PCR、Westernblotting检测细胞EzrinmRNA和蛋白表达水平,筛选出1对干预效果最好的EzrinsiRNA。2.将干预效果最好的EzrinsiRNA、ScramblesiRNA分别转染MG-63细胞,并设立1组未转染的空白对照组,采用MTT法检测细胞增殖；3.通过Transwell迁移、侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力,细胞黏附实验测定细胞的黏附能力4.利用Westernblotting检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白、Src、磷酸化Src(p-Src)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)表达；5.30只裸鼠随机分成3组：空白对照组(n=10)、ScramblesiRNA组(n=10)和EzrinsiRNA组(n=10),分别通过鼠尾静脉注射未转染siRNA、转染ScramblesiRNA及EzrinsiRNA的MG-63细胞,第42天处死裸鼠,比较实验前后体重及肺表面结节个数。结果：1.EzrinsiRNA3对EzrinmRNA和蛋白表达的抑制作用优于EzrinsiRNA1、EzrinsiRNA2(P<0.01),因此本研究选择EzrinsiRNA3进行后续研究；2.在24h、48h和72h,EzrinsiRNA组吸光度(OD)值小于空白对照组、ScramblesiRNA组(P<0.05);3.Transwell迁移、侵袭实验显示,EzrinsiRNA组穿膜细胞数明显低于空白对照组、ScramblesiRNA组(P<0.05),同时,EzrinsiRNA组细胞黏附率较空白对照组、ScramblesiRNA组降低(P<0.05)；4.与空白对照组、ScramblesiRNA组比较,EzrinsiRNA组MMP-2、MMP-9、N-钙粘蛋白、波形蛋白、p-Src、p-Akt表达水平降低(P<0.01),而E-钙粘蛋白表达水平升高(P<0.01),但Src、Akt表达水平无变化(P>0.05)；5.EzrinsiRNA组实验后裸鼠平均体重较空白对照组、ScramblesiRNA组增加(P<0.05),但肺表面结节个数较空白对照组、ScramblesiRNA组减少(P<0.05)。结论：1.运用siRNA下调Ezrin蛋白表达可抑制MG-63细胞增殖、侵袭和转移；2.EzrinsiRNA对MG-63细胞侵袭、转移的抑制作用是通过降低MMP-2、MMP-9、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达、增加E-钙粘蛋白表达以及抑制Src、Akt磷酸化实现的。图22幅,表9个,参考文献53篇。目的：观察黄芩素对MG-63细胞增殖、侵袭及Ezrin表达、活性的影响,探讨黄芩素治疗骨肉瘤的相关机制。方法：1.体外培养MG-63细胞,利用无水乙醇将黄芩素稀释成6个浓度梯度：1、2、4、8、16.32μmol/L,分别处理细胞24h、48h、72h,采用MTT法检测细胞增殖,选择黄芩素干预48h,计算黄芩素作用的50%抑制浓度(50%inhibitoryconcentration,IC50)；2.随后以无水乙醇(对照组)及10.15gmol/L黄芩素处理MG-63细胞48h,采用Transwell迁移、侵袭实验检测各组细胞的迁移、侵袭能力；3.通过细胞黏附实验测定细胞的黏附能力；4.行荧光实时定量PCR.Westernblotting检测EzrinmRNA及Ezrin、磷酸化Ezrin(p-Ezrin)蛋白表达。结果：1.随着黄芩素浓度的增加和处理时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐升高,差异均有显著性(P<0.01),黄芩素干预48h对MG-63细胞增殖的IC50约为18.35μmol/L:2.Transwell迁移、侵袭实验显示,10.15μmol/L黄芩素组穿膜细胞数均低于对照组(P<0.05,0.01),黄芩素15μol/L组穿膜细胞数又低于10μmol/L组(P<0.05)；3.10、15μmol/L黄芩素组细胞黏附率较对照组降低(P<0.05,0.01),且黄芩素15μmol/L组细胞黏附率低于10μmol/L组(P<0.05),4.与对照组比较,10、15μmol/L黄芩素组EzrinmRNA和Ezrin、p-Ezrin蛋白表达水平明显降低,(P<0.05,0.01),黄芩素15μmol/L组上述指标低于10μmol/L组(P<0.05)。结论：1.黄芩素呈时间和剂量依赖性抑制MG-63细胞增殖；2.黄芩素可下调EzrinmRNA、蛋白表达及其磷酸化活化水平。图9幅,表2个,参考文献37篇。
【作者】张健；
【导师】张朝跃；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】骨肉瘤；Ezrin蛋白；免疫组化；小干扰RNA；基质金属蛋白酶-9；E-钙粘蛋白；黄芩素；

【参考文献】
[1]陈秀实.基于智能技术的用电预测数据挖掘(DM)模型的建立[J].自动化技术与应用,2003,06:16-20.
[2]刘学英.脂肪酶催化合成（S）-吲哚洛芬及其与小分子相互作用机理[D].湘潭大学,化学工程与技术,2014,博士.
[3]叶云广.基于Android平台的远程医疗家庭监护系统研究[D].广东技术师范学院,系统理论,2013,硕士.
[4]王艳君.微型移动学习资源的设计与实现研究[D].沈阳师范大学,教育技术学,2013,硕士.
[5]高亚楠.Y主题酒店竞争优势研究[D].延安大学,企业管理,2014,硕士.
[6]石俊杰.基于云存储的重复数据删除文件系统设计与实现[D].华中科技大学,计算机技术,2013,硕士.
[7]苗世洪,刘沛,林湘宁,罗承廉,胡家跃.基于数据网的新型广域后备保护系统实现[J].电力系统自动化,2008,10:32-36+41.
[8]牛健.MOCVD生长量子阱激光器材料及结构的优化设计[D].河北工业大学,微电子学与固体电子学,2004,硕士.
[9]徐敬领,王贵文,刘洛夫,张春花,薛宗安.应用Hilbert-Huang变换方法研究等时小层划分及对比[J].石油地球物理勘探,2010,03:423-430+472+317-318.
[10]陈福集.电子政务系统中面向公众的信息集成化管理与个性化服务研究[D].合肥工业大学,2004.
[11]纪晓佳.糯米浆三合土的物理力学性能研究[D].浙江大学,防灾减灾工程及防护工程,2013,硕士.
[12]赵思辰.我国商业银行跨国并购的动因和风险分析[D].武汉理工大学,国际贸易学,2012,硕士.
[13]李园园.RNA恒温扩增实时检测技术鉴定常见致病非结核分枝杆菌研究[D].苏州大学,微生物学,2014,硕士.
[14]牛延超.无线传感器网络非测距定位技术研究[D].北京交通大学,2010.
[15]牛海宏.试论民事自认制度[D].中国政法大学,法律,2003,硕士.
[16]陈增强,袁著祉.神经网络建模在热膨胀螺栓形变测量中的应用[J].控制与决策,2001,01:117-119.
[17]雷君.QR汽车公司战略转型研究[D].安徽大学,工商管理,2013,硕士.
[18]杨珍珍.目的论观照下的博物馆解说词英译研究[D].宁波大学,英语语言文学,2013,硕士.
[19]刘利.碳纳米管增强增韧不相容共混物PP/EVA的研究[D].西南交通大学,2010.
[20]张彩良.基于碳平衡原理的在用天然气汽车燃气消耗量检测方法研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[21]胡思行.我的美，由你来发现[D].浙江大学,新闻与传播（专业学位）,2013,硕士.
[22]何敏.玻璃体内注射维生素E防治增生性玻璃体视网膜病变[D].山西医科大学,眼科学,2002,硕士.
[23]胡佳寅.沥青混合料级配离析特性的分形评价与控制技术研究[D].长安大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[24]杨丽莉.引黄灌区经济生态系统水资源高效利用调控技术研究[D].郑州大学,水文学及水资源,2013,硕士.
[25]闫玉麟.ATP干馏装置处理小颗粒页岩的试验与研究[D].吉林大学,化学工程,2012,硕士.
[26]胡斌.L公司配套供热改造项目的可行性研究[D].西南交通大学,项目管理（专业学位）,2014,硕士.
[27]林国新,田业,钱未未.数据仓库中异构数据的资源整合及挖掘[J].电力信息化,2004,09:46-49.
[28]马慧芳.利用纤维材料生产L-乳酸的研究[D].内蒙古工业大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[29]张治涛.面向广播新闻的语音自动检索技术研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[30]毛淑波.罗伦隐球酵母结合热空气处理对草莓采后病害的防治及其机理研究[D].南京农业大学,食品科学,2013,硕士.
[31]黄小鹃.东汉的河北势力研究[D].湖南师范大学,中国古代史,2013,硕士.
[32]莫申生.制度安排视角下的中国金融结构调整与经济发展[D].浙江大学,政治经济学,2014,博士.
[33]张永大.数据挖掘在客户关系管理系统中的应用[J].福建电脑,2003,06:21-23.
[34]尹永芹.茖葱的化学成分研究[D].黑龙江中医药大学,中药学,2004,硕士.
[35]肖红.基于信息资源多种模式的建设探讨[J].中国科技信息,2005,24:96+112.
[36]于大洋,黄海丽,雷鸣,李新,张波,韩学山.电动汽车充电与风电协同调度的碳减排效益分析[J].电力系统自动化,2012,10:14-18.
[37]魏嫄.需求波动下的Milk-Run模式库存运输联合优化研究[D].山东大学,物流工程,2013,硕士.
[38]高建设.中国养老基金安全运作的制度研究[D].福建师范大学,政治经济学,2004,硕士.
[39]曹令坤.涉外收养口译实践报告[D].河北师范大学,翻译,2014,硕士.
[40]周志明.渤海石刻文献研究[D].东北师范大学,历史文献学,2012,硕士.
[41]于淼.天然源面波在煤炭采空区的应用技术研究[D].吉林大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[42]刘元龙.基于路径的OCV分析方法研究与实现[D].国防科学技术大学,软件工程,2013,硕士.
[43]刘燕萍.PCOS中西医结合促排卵助孕的临床研究[D].云南中医学院,中西医结合临床（专业学位）,2012,硕士.
[44]张龙妹.我国专业运动员职业生涯规划与管理研究[D].沈阳体育学院,社会体育指导,2014,硕士.
[45]牛鹏飞.基于RFID的现代物流管理系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[46]陈慧.城市化：产业结构与产业集聚关系研究[D].天津商业大学,政治经济学,2013,硕士.
[47]张晓庆.C-G-Ha-HS支架协同PCA对NS/PCs分化作用研究[D].大连理工大学,生物医学工程,2013,硕士.
[48]刘悦宇.基于IEC 61375-2-5的列车网络仿真及冗余切换软件设计与实现[D].西南交通大学,控制工程,2014,硕士.
[49]齐文闯.南方鲇（Silurus meridionalis Chen）性腺体细胞系的建立、鉴定及应用[D].西南大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[50]陈培.PKI/CA管理域间交叉认证模式研究[D].对外经济贸易大学,产业经济学,2004,硕士.