大麻素Ⅱ型受体激动剂改善阿尔茨海默病样小鼠学习记忆能力的神经炎症机制研究

【摘要】目的：以大麻素II型受体（cannabinoid2receptor,CB2R）激动剂为研究工具，研究CB2R对β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）诱导的小鼠学习记忆能力损伤的改善作用及其调节小胶质细胞功能表型转化的神经源性炎症作用机制。为确立CB2R作为新的抗神经源性炎症候选药物靶标提供进一步的实验证据，为治疗阿尔茨海默病提供新的药物治疗策略。方法：1CB2R激动剂对AD模型小鼠空间及非空间学习记忆能力的影响根据自发活动的研究数据将10周龄雄性C57/Bl6J小鼠随机分为对照组，AD模型组，CB2R激动剂JWH-015干预组和JWH-015单药组。对照组和JWH-015单药组侧脑室一次性注射生理盐水8μl。AD模型组和JWH-015干预组动物侧脑室一次性注射寡聚态Aβ1-424μg（8μl），以建立AD模型。造模后第2天开始，JWH-015干预组和JWH-015单药组小鼠腹腔注射JWH-015（0.5mg/kg/天），对照组和AD模型组小鼠每天腹腔注射等体积含0.1%DMSO生理盐水，连续给药3周。采用Morris水迷宫实验及新物体识别实验观察CB2R激动剂对AD模型小鼠空间及非空间学习记忆能力的改善作用。2CB2R激动剂对AD模型小鼠脑内胶质细胞功能形态及数量的影响通过组织免疫荧光技术观察上述不同组别实验动物脑内小胶质细胞标志物（CD11b）和星形胶质细胞标志物（GFAP）的表达情况和CB2R激动剂对上述改变的影响。3CB2R激动剂对Aβ诱导的小胶质细胞功能和激活表型的影响采用实时定量PCR技术，观察海马、纹状体、前额叶等脑区的CB2R，M1型激活小胶质细胞标志物TNF-α、iNOS、IL-6及M2型激活小胶质细胞标志物Ym1/2mRNA的表达情况。4CB2R对LPS诱导的小胶质细胞功能表型的调节机制通过WesternBlot的方法观察CB2R对LPS诱导的激活小胶质细胞内丝裂原活化蛋白激酶信号通路ERK、JNK及p38MAPK磷酸化水平的影响，探讨CB2R参与小胶质细胞激活功能表型调节的信号传导机制。结果：1CB2R激动剂改善AD模型小鼠空间和非空间学习记忆能力Morris水迷宫实验结果显示，在定位航行实验中，AD模型组小鼠逃避潜伏期较对照组小鼠显著延长（P<0.01）；在空间探索实验中，与对照组相比，AD模型组小鼠1分钟穿越平台次数显著减少（P<0.05）；新物体识别实验结果显示，与对照组相比，AD模型组小鼠新物体识别指数显著下降（P<0.05），提示AD模型建立成功。与AD模型组小鼠相比，JWH-015干预组小鼠逃避潜伏期显著缩短（P<0.05），1分钟穿越平台次数显著增加（P<0.05）；JWH-015干预组小鼠新物体识别指数较AD模型组小鼠相比显著增加（P<0.05），提示CB2R激动剂能够改善AD模型小鼠空间及非空间学习记忆能力；JWH-015单药组小鼠与对照组相比，逃避潜伏期、1分钟穿越平台次数及新物体识别指数均无显著变化（P>0.05）；此外，各组小鼠体重及自发活动未见组间差异，提示JWH-015不影响正常小鼠体重及精神活动。2CB2R激动剂抑制脑内胶质细胞激活数量通过免疫组化的方法检测不同处理组小鼠纹状体脑区小胶质细胞和海马脑区星型胶质细胞的激活与表达情况。与对照组相比，AD模型组小鼠纹状体脑区小胶质细胞标记物CD11b表达明显增高，形态表现为分枝状（激活状态）；JWH-015干预组小鼠纹状体脑区CD11b的表达与AD模型组相比明显下降；JWH-015单药组较对照组未见明显差异。AD模型组小鼠海马脑区星型胶质细胞标志物GFAP较对照组表达显著增高；JWH-015干预组小鼠GFAP的表达水平较AD模型组有减少的趋势；JWH-015单药组与对照组相比没有明显差异。3CB2R调节脑内Aβ诱导的小胶质细胞M1/M2激活表型的转化3.1Aβ诱导脑内不同脑区CB2RmRNA表达水平上调与对照组相比，AD模型组小鼠海马、纹状体和前额叶等脑区CB2RmRNA表达均显著上调（海马P<0.01，纹状体和前额叶P<0.05）。与AD模型组相比，JWH-015干预组小鼠海马、纹状体和前额叶等脑区CB2RmRNA表达水平均显著下调（海马P<0.01，纹状体和前额叶P<0.05）。3.2CB2R激动剂降低M1型激活小胶质细胞标记物mRNA表达水平在海马脑区，与对照组小鼠相比，AD模型组小鼠iNOSmRNA表达水平显著上调（P<0.01）。与AD模型组相比，CB2R激动剂干预组小鼠iNOSmRNA表达水平显著下调（P<0.01）。模型组IL-6，TNF-αmRNA表达呈上调趋势，JWH-015干预组IL-6，TNF-αmRNA表达呈下调趋势。单药组与对照组相比，其TNF-α、iNOS、IL-6mRNA表达未见明显改变（P>0.05）。在纹状体脑区，AD模型组小鼠脑内iNOS，IL-6，TNF-αmRNA表达较对照组均显著升高（P值分别为P<0.01、P<0.01和P<0.05）。与模型组相比，JWH-015干预组小鼠脑内iNOS，IL-6，TNF-αmRNA的表达显著下调（分别为P<0.01、P<0.01和P<0.05）。与对照组相比，单药组TNF-α、iNOS、IL-6mRNA表达无显著差异（P>0.05）。在前额叶脑区，与对照组相比，AD模型组小鼠脑内iNOS，IL-6mRNA表达显著上调（P值分别为P<0.01，P<0.05）。与AD模型组相比，JWH-015干预组小鼠脑内iNOS，IL-6mRNA表达显著下调（P均<0.01）。TNF-αmRNA表达各组间未见显著改变（P>0.05）。上述实验结果表明，CB2R激动剂JWH-015通过激活CB2R可下调AD模型小鼠脑内M1型激活小胶质细胞数量及其促炎症功能。3.3CB2R激动剂上调M2型激活小胶质细胞标记物mRNA表达在海马脑区，与对照组小鼠相比，AD模型组小鼠脑内M2型激活小胶质细胞标记物Ym1/2mRNA表达显著下调（P<0.05）。与AD模型组相比，JWH-015干预组小鼠脑内Ym1/2mRNA表达水平显著上调（P<0.05）。在纹状体脑区，与对照组小鼠相比，AD模型组小鼠脑内Ym1/2mRNA表达水平显著下调（P<0.05），JWH-015干预组小鼠脑内Ym1/2mRNA表达水平呈升高趋势，统计学没有显著差异（P>0.05）。在前额叶脑区，AD模型组小鼠脑内Ym1/2mRNA表达水平较对照组显著下调（P<0.05）。与AD模型组相比，JWH-015干预组小鼠脑内Ym1/2mRNA表达水平显著上调（P<0.01）。JWH-015单药处理组Ym1/2mRNA表达水平较对照组无显著差异（P>0.05）。上述实验结果表明，CB2R激动剂JWH-015可上调AD模型小鼠脑内M2型激活小胶质细胞表达及其抗炎作用。4CB2R激动剂显著抑制LPS诱导的M1型BV-2小胶质细胞ERK1/2和JNK磷酸化水平与对照组相比，LPS处理组BV-2小胶质细胞ERK磷酸化水平显著增高（P<0.01）；JWH-015低剂量处理组（10nM）与LPS处理组相比，ERK1/2磷酸化水平呈下降趋势；JWH-015中剂量（100nM）及高剂量组（1μM）BV-2小胶质细胞ERK1/2磷酸化水平显著下调（P<0.01）；JWH-015中浓度（100nM）组对LPS诱导的BV-2小胶质细胞ERK1/2磷酸化水平升高的抑制作用可被CB2R拮抗剂SR144528所显著阻断（P<0.05）。与对照组相比，LPS处理组BV-2小胶质细胞内JNK磷酸化水平显著增高（P<0.05）；JWH-015能浓度依赖性地抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞的JNK磷酸化水平；JWH-015中浓度（100nM）组对LPS诱导的BV-2小胶质细胞JNK磷酸化水平升高的抑制作用可部分被CB2R拮抗剂SR144528阻断。实验结果提示，CB2R激活后，下调ERK和JNK两个信号分子的磷酸化水平，因此，阻断MAPK信号通路过度激活可能是JWH-015抑制M1型激活小胶质细胞表达和抑制其促炎作用的信号转导机制之一。结论：选择性CB2R激动剂JWH-015对Aβ诱导的AD模型小鼠学习记忆能力具有改善作用，其作用机制可能与其抑制MAPK信号通路过度活化，调节小胶质细胞激活数量及功能表型，进一步抑制不同脑区内神经炎症反应，减轻神经元损伤相关。
【作者】王立宽；
【导师】贾慧群；李锦；
【作者基本信息】河北医科大学，麻醉学，2014，硕士
【关键词】大麻素II型受体；阿尔茨海默病；学习记忆；小胶质细胞表型；丝裂原活化蛋白激酶；

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