TGF-β1诱导乳腺癌细胞向肿瘤干细胞转化的EMT机制研究以及化疗对干细胞相关指标的影响

【摘要】目的：通过TGF-β1诱导乳腺癌细胞发生的上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT），研究EMT能否使肿瘤干细胞相关标志物的表达发生变化，并讨论其意义。方法：将人乳腺癌细胞株MCF-7置于37℃，饱和湿度5%CO2，含10%胎牛血清RPMI-1640培养基中进行常规培养，待细胞进入对数生长期后用于实验。实验分两组，实验组MCF-7细胞培养时加入TGF-β1，使其浓度达到10ng/ml，对照组加入等量PBS液。1.TGF-β1诱导培养MCF-7细胞发生EMT的形态学观察:将TGF-β1作用于MCF-7细胞株，在倒置相差显微镜下定时观察细胞的形态变化。2.细胞增殖实验（MTT法）检测TGF-β1对细胞增殖的影响。3.应用24孔Transwell侵袭小室进行MCF-7细胞的侵袭试验，检测TGF-β1对MCF-7细胞株侵袭能力的影响。应用细胞划痕实验检测TGF-β1对MCF-7细胞株迁移能力的影响。4.RT-PCR检测TGF-β1处理72h后细胞中干细胞相关标记物Oct4基因和EMT相关标记物E-cadherin基因、N-cadherin基因的表达情况。Westernblot检测TGF-β1处理后细胞中干细胞相关标记物Oct4蛋白和EMT相关标记物E-cadherin蛋白、N-cadherin蛋白的表达情况。5.流式细胞术检测TGF-β1处理5d后MCF-7细胞中CD44+CD24-细胞亚群的比例。6.应用SPSS13.0统计软件进行分析。结果：1.倒置显微镜下观察MCF-7细胞的形态学变化结果：观察发现，TGF-β1刺激72h后，MCF-7细胞发生了表型改变，细胞呈纺锤形，细胞间连接减弱，部分细胞伸出伪足，细胞排列不规则。亲代MCF-7细胞呈现出典型的上皮细胞形态，连接紧密，成团生长。2.MTT实验检测结果：TGF-β1对乳腺癌细胞MCF-7生长增殖无显著影响。TGF-β1对乳腺癌细胞MCF-7生长促进作用不明显，对照组和实验组之间差异无统计学意义（P>0.05）。3.细胞侵袭实验、细胞划痕实验结果：Transwell侵袭小室培养细胞48h后，显微镜下观察MCF-7细胞穿过基底膜细胞数：对照组，TGF-β1（10ng／ml）组分别为（200±10）、（84±9）个/高倍视野（×100）。经TGF-β1处理的MCF-7细胞穿过Transwell小室的细胞数明显多于对照组（P<0.05）。细胞划痕实验显示TGF-β1处理过的MCF-7细胞迁移能力更强，差距有统计学意义（P<0.05）。4.RT-PCR、蛋白印记检测结果：RT-PCR、蛋白印记分析结果显示，与对照组MCF-7细胞相比，经TGF-β1处理过的MCF-7细胞中干细胞相关标记物Oct4和EMT相关标记物N-cadherin的基因和蛋白表达水平均显著提高。而EMT相关标记物E-cadherin的表达与此相反（P＜0.05）。5.流式细胞术检测结果：流式细胞术检测结果显示，经TGF-β1作用后乳腺癌细胞MCF-7中CD44+CD24-亚群的细胞比例明显增加（P＜0.05）。说明经TGF-β1作用后，乳腺癌细胞中干细胞比例有所增加。结论：1.TGF-β1对癌乳腺癌细胞株MCF-7生长增殖无显著影响。2.TGF-β1可以诱导MCF-7细胞向间充质细胞形态转化，促进EMT的发生，上调干细胞标志物Oct4、间质细胞标志物N-cadherin的基因及蛋白表达水平，而下调上皮细胞标志物E-cadherin的基因及蛋白表达水平，侵袭转移能力增强。TGF-β1诱导乳腺癌细胞发生EMT能够增加干细胞比例。目的：研究40例新辅助化疗乳腺癌患者干细胞相关指标Oct4的表达与病理化疗反应分级的关系，探讨肿瘤干细胞对新辅助化疗的反应。方法：1.2010年3月至2011年1月收治II-III期需行术前化疗的原发乳腺癌患者共40例，给以紫杉类联合蒽环方案行4周期新辅助化疗。化疗结束后行根治性手术治疗，术后通过病理化疗反应分级评价化疗疗效，同时用免疫组织化学法检测患者干细胞相关指标Oct4的表达情况，分析其与病理化疗反应分级的关系及对患者预后的影响。结果:患者干细胞相关指标Oct4在化疗后乳腺癌组织中的阳性表达率为52.5%（21/40），病理反应分级Ⅰ-Ⅲ级患者乳腺癌Oct4阳性表达率60%（12/20），虽然高于病理反应分级达Ⅳ-Ⅴ级患者乳腺癌Oct4阳性表达率45%（9/20），但差异无统计学意义（P>0.05）。结论:说明Oct4的表达与术后病理反应分级之间无明显联系。
【作者】王霏霏；
【导师】单保恩；艾军；
【作者基本信息】河北医科大学，临床检验诊断学，2014，硕士
【关键词】乳腺癌；MCF-7；上皮间质转化；肿瘤干细胞；转化生长因子-β1；新辅助化疗；

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