miRNA-210及其靶基因EFNA3对恶性外周神经鞘瘤（MPNST）的增殖和侵袭能力的机制研究

【摘要】背景：恶性外周神经鞘瘤(MPNST)被认为是起源于施旺细胞或神经嵴细胞的多能细胞的罕见肉瘤。半数的PNST的发生和1型神经纤维瘤病(NF1)密切相关,NF1是一种良性外周神经肿瘤,其发生率占总人口的0.02%。尽管MPNST的发生率不高,但是MPNST在儿童的发生比例占所有软组织肉瘤的4%到10%,并且通常都是致命的。对于MPNST的主要治疗手段一般为手术治疗,但是这种治疗手段经常不能完全切除肿瘤组织。而其它的治疗手段包括化疗和放疗的治疗效果还不是很理想。因此,发展新的治疗MPNST是目前临床上继续的。随着分子生物学技术的发展,分子靶向治疗被认为是治疗MPNST非常有前景且有效的治疗手段。小分子RNA(microRNA,miRNA)是一簇具有18-25个核苷酸长度的短小的非编码RNA,主要通过促进mRNA的降解或者翻译抑制来参与对一系列人类基因的表达抑制。MiRNA已经被证明能够调节许多细胞活动,包括细胞增殖、分化、死亡和代谢等。异常表达的miRNA与癌症发生和恶性肿瘤的发生发展密切相关,因此对许多恶性肿瘤的诊断和预后具有极大的潜力。此外,积累的研究表明miRNA还能够作为一种功能强大的工具用于治疗许多恶性肿瘤。MiRNA-210是目前为止发现最重要的一种miRNA,它参与了对细胞增殖、DNA修复、代谢和细胞迁移等细胞活动。越来越多的数据表明miRNA-210是一种低氧或缺氧诱导的miRNA,并被缺氧诱导因子(HIF)所调控。由于miRNA-210在低氧条件下被HIF所调控,miRNA-210在许多中癌症包括神经胶质瘤、肾透明细胞癌、肺癌和乳腺癌等组织中表达上调。而且,miRNA-210被发现作为癌基因能够通过调节细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭参与了癌症的发生和发展。然而,直到目前,miRNA-210在MPNST中的作用和机制还不是很清楚。因此,研究]miRNA-210对MPNST细胞增殖和侵袭能力的影响以及分析其潜在的分子机制将有助于理解MPNST的病理,并因此发展潜在治疗MPNST的手段。第一部分.MiRNA-210对MPNST增殖和侵袭的影响目的：(1).检测miRNA-210在MPNST中的表达。(2).研究miRNA-210在MPNST的增殖和侵袭中的作用。方法和结果：(1).通过Real-timePCR实验检测rniRNA-210在SK-N-SH细胞和MPNST细胞系包括ST88-14、sNF96.2、T265p21和YST-1的表达,发现miRNA-210在ST88-14和sNF96.2细胞中表达极大的上调。(2).分别转染pre-miRNA-210、pre-con、anti-miRNA-210或anti-con进入ST88-14和sNF96.2细胞中。通过MTT和克隆形成实验发现,相比于转染对照,转染pre-miRNA-210的ST88-14和sNF96.2细胞的细胞生存率和克隆形成效率明显增加。相反,相比于对照,转染anti-miRNA-210的ST88-14和sNF96.2细胞的增殖和克隆形成效率下降了。(3).流式细胞术结果证明转染pre-miRNA-210进入ST88-14和sNF96.2细胞后能够显著的增加S期细胞。相反,转染anti-miRNA-210进入ST88-14和sNF96.2细胞后则显著的减少了S期细胞。(4).Transwell小室实验证明了转染pre-miRNA-210进入ST88-14和sNF96.2细胞后显著增加了细胞侵袭能力。然而,通过转染anti-miRNA-210抑制ST88-14和sNF96.2细胞中内源的rniRNA-210的表达减少了细胞侵袭能力。结论：(1).MiRNA-210在MPNST细胞ST88-14和sNF96.2中表达升高。(2).MiRNA-210促进了MPNST细胞的增殖和侵袭能力。第二部分.MiRNA-210在MPNST中靶向抑制了EFNA3基因的表达目的：(1).识别miRNA-210在MPNST细胞中调控的靶基因。(2).研究miRNA-210在MPNST细胞中调控EFNA3基因的分子机制。方法和结果：(1).通过实时定量PCR检测rniRNA-210在MPNST细胞系ST88-14和sNF96.2细胞中对潜在的靶基因包括EFNA3、MNT、AIFM3、ZNF462、GIT2(PKL)的表达水平的影响,结果表明在ST88-14和sNF96.2细胞中EFNA3表达显著降低。(2).生物信息学对EFNA3基因mRNA的3’非翻译区进行分析,识别了一个潜在的miRNA-210结合位点。(3).分别将野生型以及突变了miRNA-210结合位点的EFNA3基因mRNA的3’非翻译区序列克隆进入报告基因载体psi-CHECK2,命名为EFNA3-3’UTR-psi-CHECK2和Mut-EFNA3-3’UTR-psi-CHECK2。通过荧光素酶报告基因实验,发现rmiRNA-210能够显著的抑制野生型报告基因载体EFNA3-3’UTR-psi-CHECK2的荧光素酶活性,而对突变型报告基因载体Mut-EFNA3-3’UTR-psi-CHECK2的荧光素酶活性没有影响。(4).通过RT-PCR和westernblot分析anti-miRNA-210、pre-miRNA-210或相应对照在MPNST细胞系ST88-14和sNF96.2细胞中EFNA3基因的表达。结果表明,转染pre-miRNA-210进入ST88-14和sNF96.2细胞中能够显著增加rmiRNA-210和减少EFNA3mRNA水平。然而,转染anti-miRNA-210进入ST88-14和sNF96.2细胞中则减少miRNA-210和增加了EFNA3mRNA水平。结论：MiRNA-210能够靶向调节EFNA3基因的表达,暗示了miRNA-210可能通过靶向抑制EFNA3基因的表达调节MPNST细胞的增殖和侵袭。第三部分.MiRNA-210介导的EFNA3基因的抑制在MPNST细胞增殖和侵袭中的作用目的：研究miRNA-210介导的EFNA3基因的抑制在MPNST细胞增殖和侵袭中的作用。方法和结果：(1).分别构建EFNA3-Talen(L)和EFNA3-Talen(L)载体,并将两个载体一起分别转染进入MPNST细胞系ST88-14和sNF96.2细胞中,分别构建EFNA3敲除细胞系包括ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen。(2).通过MTT分析miRNA-210过表达对EFNA3敲除细胞系包括ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen稳定细胞系以及对照细胞增殖能力的影响。结果表明,转染miRNA-210进入ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen稳定细胞系后的增殖速度并不快于miRNA-210转染的对照细胞。(3).通过Transwell实验分析miRNA-210过表达对空白细胞或EFNA3敲除细胞系包括ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen稳定细胞系侵袭能力的影响。结果表明,转染miRNA-210的EFNA3敲除细胞系的侵袭能力强于转染miRNA-210的空白对照细胞系。结论：MiRNA-210诱导的EFNA3表达抑制只是部分促进了MPNST细胞的增殖。MiRNA-210的靶基因EFNA3参与了MPNST侵袭的抑制。主要创新点：1.首次研究了niRNA-210促进MPNST细胞增殖和侵润中的作用。2.首次发现miRNA-210在MPNST细胞中负调控了EFNA3基因的表达。3.首次研究了miRNA-210/EFNA3在MPNST增殖和侵润中的作用,暗示了miRNA-210/EFNA3可能能够作为治疗MPNST的靶。
【作者】王正光；
【导师】尹邦良；吕国华；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】MPNST；miRNA-210；EFNA3；细胞增殖；侵袭；

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