人免疫球蛋白G的Fab和Fc片段制备及层析分离研究

【摘要】人免疫球蛋白G(hIgG)在木瓜蛋白酶的作用下降解为Fab片段和Fc片段,相较于完整的抗体,抗体片段在生理和临床上有许多独特的意义。此外,探讨不同抗体片断与层析介质间的相互作用,也能为抗体分离纯化优化和新型配基设计提供实验依据。本论文从抗体片段的制备入手,研究不同混合模式层析介质对抗体片段的吸附情况,探讨抗体片段分离纯化新方法。主要结果如下：首先优化了木瓜蛋白酶降解血清来源人免疫球蛋白G的酶解条件,并制备了Fab和Fc片段。通过调节酶解反应pH、酶加入量、半胱氨酸加入量以及酶解反应时间等,优化酶解反应过程,得到Fab和Fc片段含量较高的酶解液。酶解优化条件为：101ng/mlhIgG、0.5mg/ml木瓜蛋白酶、10mmM半胱氨酸、2rnMEDTA,pH7.6,酶解时间4h,hIgG的酶解转化率达到98%以上,并且杂片段含量较少。酶解液通过ProteinA亲和层析和DEAE阴离子交换层析两步法纯化,得到Fab片段纯度96.6%,收率为40.1%,Fc片段纯度95.7%,收率为72.6%。利用自制的抗体Fab片段和Fc片段,考察了MEPHyperCel、Captoadhere和ToyopearlMX-Trp-650M三种混合模式层析介质对抗体片段的吸附情况,发现阴子离交换型混合模式介质Captoadhere对两种片段有一定的选择性,在pH7-pH8附近对Fc片段的吸附能力要显著强于Fab片段。MEPHyperCel介质和ToyopearlMX-Trp-650M介质对两种片段的吸附在不同pH下差异均不大。结合优化的酶解条件以及混合模式层析对Fab片段和Fc片段的吸附差异,选用Captoadhere介质,在pH7.5下对酶解液进行层析分离,并通过ProteinA亲和层析检测组分含量。发现Fc片段几乎完全被Captoadhere介质捕获,穿透峰仅含Fab片段,实现了抗体片段的有效分离。本文优化了木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G的酶解条件,采用ProteinA亲和层析和DEAE阴离子交换层析两步法制备了较高纯度的Fab片段和Fc片段,考察了混合模式层析介质对两种片段的吸附差异,并实现了混合模式层析分离抗体片段。研究结果有助于开发抗体片段制备的新工艺,以及探讨混合模式层析分离抗体的机制研究和配基优化设计。
【作者】唐思远；
【导师】林东强；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2013，硕士
【关键词】人免疫球蛋白G；Fab片段；Fc片段；亲和层析；离子交换层析；混合模式层析；

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