香蕉microRNA及其靶基因的生物信息学预测与功能初步分析

【摘要】microRNA(miRNA)是一类在真核生物和某些DNA病毒中发现的长约19-25nt、非编码、内源性的单链小分子RNA,在基因表达调控中通过与靶mRNA的序列互补可以对靶mRNA进行降解或抑制蛋白质翻译发挥转录后水平的负调控作用。越来越多的研究表明miRNA参与植物生命过程中一系列重要进程,主要包括：个体生长发育的调控；细胞、组织分化的调控；基因表达的调控等。此外miRNA对环境胁迫如干旱、盐害、贫瘠等病原菌侵害的响应等方面也起着重要作用。然而截至目前在miRNA数据库中还没有登录香蕉miRNA的相关数据。本研究利用生物信息学方法,根据miRNA在植物中的高度保守性及其前体的二级结构特征,在香蕉的EST和GSS数据库中筛选潜在的香蕉miRNA,并从miRNA的序列特征、miRNA家族的多样性及其靶基因的功能等方面进行了深入分析。最后通过茎环引物的RT-PCR策略验证了香蕉中所预测的部分miRNA和靶基因,又通过实时定量RT-PCR技术系统研究了部分mniRNA及其靶基因在香蕉根系、叶片、花和果实4种组织中的差异表达。这将为香蕉miRNA的研究奠定基础。同时也为揭示香蕉生长发育的调控机理以及抗逆胁迫等提供理论依据。本论文主要包括以下八个方面的内容：1.采用生物信息学方法,利用现有miRNA数据库收录的已知植物miRNA序列为探针,经过严格的筛选,在香蕉的EST和GSS数据库搜索到了香蕉中33条潜在miRNA,它们来自于18个不同的前体,分布在16个不同的miRNA家族。序列分析表明这33条miRNA的前体序列长度在77-176bp之间；成熟体序列长度在20-22bp之间。通过在线软件psRNATarget预测出25条香蕉miRNA的91个可能的靶基因。这些靶基因属于不同的基因家族编码的蛋白参与了香蕉转录调控、生长发育、新陈代谢以及胁迫响应等生物学过程。2.利用从miRBase数据库下载的具有代表性的14种双子叶植物的miRNA和5种单子叶植物的miRNA,统计在本研究中预测的16个miRNA家族的物种分布情况。结果表明,16个miRNA家族中的11个属于保守性的miRNA家族,这些保守性的miRNA家族在双子叶植物和单子叶植物中都有发现。低度保守性的miRNA家族为miR157、miR1310、miR4995和miR5538。同时选取了具有代表性的miR156家族构建了其种系发育树,研究了miRNA的分子进化情况。3.利用改进的CTAB法在香蕉幼嫩叶片中成功富集到了小于150bp的小分子RNA,并以小分子RNA为模板,利用茎环引物的RT-PCR策略验证了香蕉中所预测的14条miRNA。结果表明,除了miR160a、miR319m和miR5538外,其余miRNA都被成功检测到了大小约75bp的扩增片段。测序结果表明75bp的扩增片段中包含有引物序列和完整的miRNA序列。4.以香蕉根系、叶片、花和果实中提取到的总RNA为模板,采用茎环引物的RT-PCR策略对本次在香蕉中预测出的12种miRNA进行了研究,同时检测了香蕉的看家基因5srRNA的扩增。结果表明,供选的12种miRNA中的8种均在香蕉不同组织中检测到了约75bp的扩增产物。而其余miRNA的表达呈现出了显著的组织特异性。其中miR166cb在香蕉根系、叶片和花中表达而在果中不表达；miR319m只在香蕉果实中检测到了其扩增产物而在其它组织未检测到；miR5538在香蕉花组织中扩增到单一的条带而在根、叶和果中未检测到其扩增产物；而miR160在4种不同的香蕉组织中均未检测出扩增产物。5.以香蕉4种组织中提取到的总RNA为模板,采用茎环引物的RT-PCR策略,选取了6个miRNA家族中具有代表性的6个靶基因(SPL、SRPK4、WRKY,GAMYB、DFR和F-box)分别设计引物验证其真实性。结果表明,除了靶基因GAMYB和DFR外,其余4个靶基因在香蕉的4种组织中均得到了有效扩增,扩增条带大小在100bp-400bp之间,可见,各靶基因在香蕉不同组织中呈现出差异性的表达模式。6.利用实时荧光定量RT-PCR技术,以5srRNA基因为内参基因,检测香蕉幼嫩叶片中9种miRNA差异表达水平。数据分析表明：当cDNA的使用量相同时,以看家基因5srRNA的表达量为0,miRNA的表达量分别为：miR156ga(0.973)、miRl56d(1.065)、miR162(0.465)、miR164e(0.868)、miR166cb(0.255)、miR167c(0.502)、miR169h(0.611)、miR399a(0.824)和miR4995(0.890)。可见这几种miRNA在叶片中存在着明显的差异表达水平。7.利用在叶片中所建立的实时荧光定量RT-PCR体系,以香蕉根系、叶片、花和果实4种组织为试材,进一步系统研究了7种miRNA的差异表达。以香蕉叶片中所检测到的这7种miRNA的表达量为1。结果显示miR167c在花(11.290)中的表达量显著高于果(3.184)、叶(1.00)和根系(0.300)；miR156d在花中的表达量最高(2.253),叶片次之(1.00),果实(0.336)第三,根系(0.165)最低；miR162在花中的表达量为(4.363),根组织次之(1.718),而在叶(1.00)和果(0.998)中的表达几乎相同；miR399a在花中的表达量(2.684)最高,在叶中表达量(1.00)高于根(0.302),而在果的表达量最低仅为(0.067),miR169h、miR4995和miR164e在4种组织中的表达量差异不明显。8.根据在香蕉miRNA实时荧光定量PCR所建立的优化体系,以香蕉叶片中所检测到的6种miRNA靶基因的表达量为1,进一步系统研究了miRNA与其所对应的靶标的表达情况。结果显示,6种miRNA靶基因在香蕉的各组织中都被检测到,并呈现出了差异性表达模式。其中,靶基因WRKY在果组织中的表达量最高为2.352,而靶基因DFR在香蕉花组织中的表达量最低为0.015。这种表达趋势与前面所验证的miRNA(miR167c(11.290)在花中的表达)在4种组织的表达呈反比关系。结果表明对靶标SPL、SRPK4以及DFR的实时荧光定量的结果较好,与之前对其miRNA的检测结果相比较,它们的表达趋势具有显著相关性。
【作者】柴娟；
【导师】张银东；
【作者基本信息】海南大学，作物遗传育种，2013，硕士
【关键词】香蕉；microRNAs；靶基因；生物信息学分析；差异表达；实时定量RT-PCR；

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