高赖氨酸转基因玉米（SB401基因）对土壤酶活性及土壤细菌群落结构的影响

【摘要】玉米是世界三大谷类作物之一,也是我国的第一大作物种类,不仅是重要的粮食来源,也是重要的饲料和工业原料。但是传统玉品种的营养品质较差,缺乏必需的氨基酸,如赖氨酸、色氨酸等,难以满足人和动物的生长发育需要。因此,发展高赖氨酸玉米品种不仅可以解决我国粮食短缺和营养不良问题,而且对促进我国畜牧业和饲料加工业的快速发展也具有十分重要的意义。然而,相对于传统玉米品种,高赖氨酸转基玉米的核酸组成发生了一定的变化,其外源基因不仅可以直接通过基因转移、扩散,对其周围环境生物产生影响,其基因的表达产物可以通过根系分泌物、脱落物及根和枝叶残体等进入土壤环境,进而对土壤环境生物产生一定影响。因此,高赖氨酸转基因玉米对土壤环境影响的评价是其大面积应用和推广的前提,其中对土壤环境微生物的影响是环境评价的重要内容,意义重大。本研究通过传统土壤酶活测定、微生物平板计数,QPCR技术和DGGE-cloning技术,以非转基因受体玉米为对照,评估高赖氨酸转基因玉米在苗期、吐丝期、成熟期和成熟后对根际土壤酶活、土壤细菌群落结构及固氮微生物群落结构的影响：1).以传统的土壤酶活测定方法对玉米四个生长时期(苗期、吐丝期、成熟期和成熟后)中根际土壤脲酶、转化酶和过氧化氢酶酶活进行测定。2).通过传统微生物平板计数方法完成了对玉米各生长时期根际土壤中真菌、细菌和放线菌的计数；并以直接法从根际土壤中提取总DNA,利用细菌通用引物扩增16SrRNA的V3区,以DGGE-cloning技术分析玉米各生长时期根际土壤样品中的细菌群落结构。3).以特异性引物扩增玉米苗期、吐丝期、成熟期和成熟后根际土壤中固氮微生物功能基因(nifH基因),并通过QPCR技术和DGGE-cloning技术分析高赖氨酸转基因玉米各生长时期中对根际土壤样品中的固氮微生物生物量和群落结构的影响。研究结果显示,1).通过传统方法对玉米根际土壤脲酶、转化酶和过氧化氢酶酶活进行了测定,以非转基因玉米为对照,评估高赖氨酸转基因玉米对其根际土壤酶活的影响。结果表明,在玉米整个生长时期(苗期、吐丝期、成熟期和成熟后)中,转化酶酶活有先升高后降低的趋势,而脲酶和过氧化氢酶酶活则不受生长时期的影响；在同一生长时期内与对照相比,高赖氨酸转基因玉米对其根际土壤脲酶、转化酶和过氧化氢酶酶活均无显著影响。2).以传统微生物平板计数和DGGE-cloning技术研究高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落结构的影响,结果显示：(1).与对照相比,转基因玉米根际土壤微生物生物量有一定的差异,在玉米不同生长时期不同的微生物群体的差异也各不相同,玉米根际土壤细菌生物量没有显著差异(显著水平为5%)；放线菌生物量在苗期结果显示,高赖氨酸转基因玉米根际放线菌生物量显著高于非转基因玉米(显著水平为5%)；而真菌计数结果显示,在玉米的吐丝期和成熟后,非转基因玉米根际土壤真菌生物量显著高于高赖氨酸转基因玉米(显著水平为5%)。(2).DGGE-cloning分析结果显示,在玉米四个生长时期内,高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落的影响各不相同,其主要优势条带发生变化也不相同：a).在玉米生长的苗期,高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落结构未产生明显影响,其主要优势细菌类群分别归属于Proteobacteria、TM7、Acidobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Firmicutes门；部分细菌类群受到一定程度的抑制,分别属于TM7、Proteobacteria和Bacteroidetes门。b).在玉米生长的吐丝期,高赖氨酸转基因玉米根际土壤细菌群落结构整体相对稳定,其主要优势细菌类群分别归属于Proteobacteria.Acidobacteria.Bacteroidetes,TM7和Nitrospirae门；部分细菌类群受到一定程度的促进作用,分别属于Acidobacteria、Bacteroidetes和Nitrospirae门。c).在玉米生长的成熟期,高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落结构整体无明显影响,其主要优势细菌类群分别归属于Proteobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Actinobacteria、TM7、Firmicutes和Verrucomicrobia门。d).在玉米生长的成熟后,高赖氨酸转基因玉米对根际土壤细菌群落结构整体相对稳定,其主要优势细菌类群分别归属于Proteobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、TM7和Firmicutes。3).以玉米根际土壤总DNA模板,对固氮功能基因nifH做QPCR和DGGE-cloning电泳分析,结果表明：(1).在玉米四个生长时期中,苗期、吐丝期和成熟期,高赖氨酸转基因玉米均未对根际土壤固氮微生物生物量产生显著影响(显著水平为5%)；在成熟后检测到高赖氨酸转基因玉米根际土壤固氮微生物生物量显著高于非转基因玉米(显著水平为5%)。(2).nifH基因DGGE电泳分析显示,在玉米四个生长时期中,转基因玉米的种植对其根际土壤固氮微生物群落结构产生了一定程度的影响；但对根际土壤固氮微生物群落多样性影响并不显著(显著水平为5%)。将特异性条带经切胶、克隆、测序建树得知,玉米根际土壤主要固氮物类群为Bradyrhizobium,Burkholderia,Azoarcus,Pelomonas,Desulfovibrio和未知菌属(Unknown)。与非转基因玉米相比,在玉米生长的苗期,减弱条带有O(Unknown)和P(Unknown),消失的条带为H(Azoarcus)和(Burkholderia);增强的条带有C(Bradyrhizobium)和F(Unknown),增加条带为K(Pelomonas)。在玉米生长吐丝期,减弱条带有C(Bradyrhizobium),E(Bradyrhizobium),L(Burkholderia),M(Burkholderia)和U(Unknown),消失的条带为F(Unkown);增强的条带为K(Pelomonas),O(Unknown)和P(Unknown),增加的条带为I(Burkholderia)和J(Unknown)。在玉米生长成熟期,增强的条带为B(Azoarcus),C(Bradyrhizobium)和R(Unknown),增加的条带为E(Bradyrhizobium),其他条带无明显变化。在玉米成熟后,减弱的条带为G(Unknown),H(Azoarcus),和(Burkholderia),增强的条带为E(Bradyrhizobium)和V(Desulfovibrio),增加的条带为A(Bradyrhizobium)。
【作者】浦传亮；
【导师】曹慧；
【作者基本信息】南京农业大学，微生物学，2013，硕士
【关键词】转基因玉米；土壤酶活；细菌多样性；固氮微生物；DGGE；nifH；

【参考文献】
[1]刘均,李人厚,郑庆华.一种基于进制转换的数值型关联规则分析方法[J].计算机工程,2005,09:17-18+33.
[2]臧润涛.面向共轨柴油机的OBD及EOL平台开发[D].浙江大学,动力机械及工程,2013,硕士.
[3]侯广强.桉木化学组分及纤维素聚集态结构对其苄基化改性的影响[D].陕西科技大学,轻工技术与工程,2013,硕士.
[4]卜琴香.汉语祈使句及其维译[D].新疆师范大学,中国少数民族语言文学,2013,硕士.
[5]王志亮.公允价值的决策有用性研究[D].北京交通大学,2009.
[6]亓同贺.新疆国税代开发票系统的设计与实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[7]杨周雨.白芍七物颗粒剂对UC大鼠免疫机制调节的实验研究[D].湖南中医药大学,中医外科学,2014,硕士.
[8]夏晓玲.我国民事非讼程序研究[D].海南大学,诉讼法学,2014,硕士.
[9]李强.用于灾难恢复的远程备份系统的研究[D].国防科学技术大学,2004.
[10]付志远.相位调制激光干涉仪信号处理方法研究[D].合肥工业大学,仪器仪表工程（专业学位）,2014,硕士.
[11]王娜娜.购买决策的影响因素：双通道心理账户的中介效应和情绪的调节效应[D].宁夏大学,应用心理学,2014,硕士.
[12]窦春青.FK506预处理对内毒素休克小鼠及重症急性胰腺炎大鼠的保护作用[D].第四军医大学,外科学,2004,硕士.
[13]李明娟.金属标签空间场的分布仿真及测量平台研究[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[14]杜杰.井下煤流矸石跳汰分选关键技术研究与应用[D].中国矿业大学,采矿工程,2014,硕士.
[15]程清芳.纳米流体在泡沫金属吸液芯热管中强化传热试验研究[D].江苏科技大学,轮机工程,2013,硕士.
[16]李海丽.对我国少数民族地区现代化几个问题的哲学思考[D].西南大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[17]卢洋.基于点模式的自动指纹识别算法研究及应用[D].南京气象学院,系统分析与集成,2004,硕士.
[18]费丹,熊磊,吴建强.基于软件无线电的无线信道仿真仪设计与实现[J].仪器仪表学报,2013,S1:93-98.
[19]查理.存量房交易税收征管系统（税务端）的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[20]周学刚.石家庄市普通高校大学生武术协会现状调查与发展对策[D].河北师范大学,民族传统体育学,2012,硕士.
[21]刘广成.江恩理论在沪、深股市的应用性研究[D].西安理工大学,工商管理,2003,硕士.
[22]李再州,王兴旺,张书棠.实现机车信号出入库系统测试[J].铁道通信信号.2001(11)
[23]吕新玲.企业环境绩效与财务绩效相关性问题研究[D].云南财经大学,会计学,2013,硕士.
[24]彭囝囡.员工感知的企业社会责任与工作绩效关系的研究[D].新疆财经大学,企业管理,2013,硕士.
[25]蒋龙.基于心理与行为特点的“95后”大学生军训思想政治教育工作模式思考[J].教育教学论坛,2015,19:40-41.
[26]田敬北,蒋建国,张国富,苏兆品,刘扬.基于云模型的Agent联盟评价[J].控制与决策,2013,01:152-156.
[27]李璋旭.蛋白质交互模块若干识别算法研究[D].吉林大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[28]胡家耀,吴植翘,宋寿山.模糊控制在退火炉燃烧过程控制中的应用[J].自动化学报,1989,06:501-507.
[29]冯东武.基于粗大轮廓的异源视觉图像匹配技术研究[D].南京航空航天大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[30]赵志瑞,焦海华,崔丙健,黄迪,曹世超,王云,刘上千,马斌,白志辉.内循环半短程亚硝化工艺运行条件与微生物群落研究[J].环境科学,2015,04:1399-1405.
[31]韩晓路.一种基于Web服务的产品推荐系统模型[J].电脑知识与技术,2004,23:55-58.
[32]全晓宇.蜘蛛对小菜蛾的捕食作用及其捕食效应的分子检测[D].湖北大学,生态学,2011,硕士.
[33]马捷.基于因子分析的浙江省茶叶出口竞争力研究[D].兰州商学院,国际贸易学,2014,硕士.
[34]汪雪梅.镍基复合电刷镀超疏水表面的制备及性能研究[D].中国矿业大学,材料学,2014,硕士.
[35]单明.基于个性化推荐的电子商务推荐系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[36]姚羽,高福祥,邓庆绪,于戈,张守智.混合前馈型神经网络在入侵检测中的应用研究[J].控制与决策,2007,04:432-435.
[37]张文武.两种后路跨伤椎椎弓根螺钉内固定术治疗胸、腰椎骨折的疗效对比分析[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[38]姜秉成.低剂量微波辐射诱导的γ射线致小鼠遗传损伤的适应性反应研究[D].苏州大学,卫生毒理学,2013,硕士.
[39]张勇.基于Android平台的远程视频监控系统关键技术研究[D].吉林大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[40]李伟.合作学习在高中生物学科教学中的实践研究[D].广西师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[41]陈智.石墨烯场效应晶体管电流模型的研究[D].苏州大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[42]朱蓉.我国地方政府财政专项绩效评价体系研究[D].华东师范大学,行政管理（专业学位）,2013,硕士.
[43]李黎.秦观散文用典研究[D].河北师范大学,中国古代文学,2012,硕士.
[44]谷秋实.上海市筹公共租赁住房制度研究[D].辽宁大学,社会保障,2012,硕士.
[45]周巧灵.农民工随迁子女义务教育公平问题研究[D].江西农业大学,思想政治教育,2012,硕士.
[46]王光远.高级中学校园景观设计[D].清华大学,设计艺术学,2012,硕士.
[47]高昆.多目标炼钢-连铸计划编制问题研究[D].内蒙古工业大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[48]陆军芳.国有企业资产证券化初探[D].复旦大学,金融学,2012,硕士.
[49]陈万林.江苏省电力消费分析及预测研究[D].南京财经大学,数量经济学,2012,硕士.
[50]翟影,阮永丰,张灵翠,刘雅丽,邱春霞.ZnO纳米棒的电致发光研究[J].人工晶体学报,2014,05:1029-1036.