大豆疫霉磷脂酰肌醇转移蛋白PsPITP1功能分析
【摘要】大豆疫霉(Phytophthorasojae)侵染大豆可引起幼苗猝死和成株的根腐病。自1948年在美国首次被发现以来,大豆疫霉根腐病已成为世界大豆生产上的主要病害之一,每年给大豆产业带来巨额经济损失。因此研究和探讨大豆疫霉的侵染及致病机制,对大豆生产及大豆疫霉病害的防治非常关键。近年来随着分子生物学及生物信息学的迅速发展,卵菌的遗传转化技术不断成熟与完善,尤其是大豆疫霉等几个疫霉种基因组序列测序完成后,以外泌蛋白为突破口的卵菌致病机制的研究取得了长足进展。而RNAi技术的成熟则为基因功能研究开拓了另一条途径,本实验将RNAi技术应用于大豆疫霉的功能基因组研究中,研究外泌相关蛋白PsPITP1的功能及其在侵染过程中所起的作用。大豆疫霉磷脂酰肌醇转移蛋白PsPITP1的生物学预测及转录分析。PITP普遍存在于真核生物细胞中,能够结合并交换一分子的磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)或磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC),并促进这两类脂分子在细胞内膜组分间的转移。PITP对细胞内膜组分间脂类的运输和代谢、分泌囊泡的形成和运输、磷脂酶C(phospholipase,PLC)调节的信号传导等生理生化过程具有重要的影响。本研究通过生物信息学方法从大豆疫霉全基因组数据库中挖掘出了一个PITP基因,分别命名为PsPITP1,通过与其它真核生物的同源性比对,发现其高度保守。利用RNA-sequencing和qRT-PCR等技术分析了PsPITP1在生活史及侵染各阶段的转录情况,发现其在侵染阶段高度上调表达,推测可能参与侵染过程。PsPITP1参与调控大豆疫霉的生长发育和致病性。利用PEG-CaC12介导的大豆疫霉遗传转化技术得到三个PsPITP1沉默突变体。表型分析表明PsPITP1沉默突变体的生长速率下降,菌落形态异常,休止孢萌发形成的菌丝生长缓慢且分枝明显比野生型多。游动孢子接种合丰47下胚轴分析发现突变体致病性显著下降。PsPITP1参与调控外泌途径和寄主的防卫反应。显色法分析发现PsPITP1影响了大豆疫霉胞外漆酶的分泌。SDS-PAGE分析发现PsPITP1影响某些胞外蛋白的分泌。活性氧染色分析发现,突变体活性氧积累明显比野生型多。显微观察侵染发现突变体不能形成侵染菌丝,侵染孔口周围寄主细胞出现类似过敏反应的坏死。突变体菌株接种合丰47后,水杨酸途径防卫相关基因PR1、茉莉酸途径防卫反应相关基因PR10均上调表达。表明PsPITP1在外泌途径和寄主的防卫反应方面具有重要调控作用。
【作者】路兆军；
【导师】王源超；
【作者基本信息】南京农业大学，植物病理学，2013，硕士
【关键词】大豆疫霉；PsPITP1；生物信息学；致病性；防卫反应；
【参考文献】
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