鼠源Ptx3蛋白的真核表达及其对感染猪链球菌2型小鼠保护作用的研究

【摘要】猪链球菌(Streptocottussuis,SS)是一种重要的人畜共患病病原体,不仅可以引起病畜产生败血症状,也可侵害中枢神经系统和其他组织,引发脑膜炎、肺炎、心内膜炎和关节炎等严重的炎性反应。近10年来,我国有237人感染猪链球菌,导致至少53人死亡的严重后果,给公共卫生带来了严重的威胁,备受世界关注。目前对猪链球菌病的治疗,我们常采用抗生素方法,这样不仅会诱使猪链球菌的耐药性增强,而且抗生素的使用也会引起药物残留,食品安全等一系列的问题,所以急需探索出一种新的、安全有效的猪链球菌病的治疗办法。Ptx3蛋白是第一个被确认的长正五聚蛋白,研究证实,Ptx3蛋白可以绑定在某些病原体上,在对抗某些病原菌的过程中发挥重要作用。随着转基因小鼠和转基因细胞的应用,陆续发现Ptx3还具有调节免疫应答,调理吞噬等作用。通过研究Ptx3和肺炎克雷伯菌外膜蛋白A(KpOmpA)之间的相互作用,发现Ptx3对微生物成分引起的炎症反应也具有调节作用等。本试验首先通过构建重组原核表达载体PET-32a-Ptx3,获得原核表达的鼠源Ptx3蛋白,并制备兔抗原核表达Ptx3蛋白血清,为鼠源Ptx3蛋白的真核表达奠定一定的试验基础。随后又构建了重组真核表达载体pIRES-egfp-Ptx3,并将重组真核表达载体转染到真核表达宿主CHO细胞中,在含有G418(700ng/mL)的F-12K营养液中培养进行阳性细胞的初步筛选。通过流式细胞仪的再次分选作用获得了能够稳定、大量表达Ptx3蛋白的单克隆细胞株。再在无血清培养基中对阳性单克隆细胞株进行传代培养,收集上清并经过葡聚糖凝胶层析系统纯化,获得纯度较高、性质稳定的真核表达鼠源Ptx3蛋白,为鼠源Ptx3蛋白功能的研究做好准备工作。通过研究在真核表达鼠源Ptx3蛋白的作用下,Ana-1细胞对SS2HA9801细菌吞噬能力的变化,观察到Ana-1细胞对HA9801的吞噬率(PA)和吞噬指数(PI)都有显著提高,说明Ptx3蛋白在体外条件下可增强Ana-1的吞噬作用。建立小鼠气囊模型,研究在体内环境下Ptx3蛋白对HA9801感染小鼠引起炎症反应的调节作用,结果表明在Ptx3蛋白作用下炎性细胞的数量与炎性因子(IL-6)的浓度都显著升高,证实Ptx3蛋白可增强HA9801感染小鼠引起炎症反应。并且在Ptx3蛋白作用下HA9801菌株在小鼠体内感染浓度明显降低,所以Ptx3蛋白对HA9801具有一定的抗感染作用。
【作者】王晓晖；
【导师】姚火春；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪链球菌2型；鼠源Ptx3蛋白；真核表达；保护作用；

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