脱氧雪腐镰刀菌烯醇噬菌体单链抗体库的构建及原核表达

【摘要】脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是由多种镰刀属真菌代谢产生的单端孢霉烯族化合物。随着小麦赤霉病的发生,DON的污染广泛分布于世界各地,是食品和饲粮中污染率最高的霉菌毒素之一。蓄积在粮食中的DON被人畜摄食后,多表现出急性的呕吐和拒食反应,并且对机体产生生长抑制、免疫抑制、胚胎和细胞毒性,对畜禽和人的健康危害极大。因此,对农产品和食品中DON的检测具有重要意义。本实验通过噬菌体抗体库技术筛选到抗DON的单链抗体,并进行初步的原核表达,为噬菌体单链抗体在DON检测中的应用奠定了良好的基础。试验Ⅰ脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原的合成通过琥珀酸酐在DON的3位羟基上引入琥珀酸连接臂,采用活泼酯法在连接臂上偶联牛血清蛋白BSA制备免疫抗原DON-HS-BSA。采用CD[法直接偶联DON和卵清白蛋白OVA制备检测抗原DON-OVA。通过紫外吸收光谱法和DON的ELISA检测试剂盒鉴定偶联成功。试验ⅡDON杂交瘤细胞的制备与鉴定以DON-HS-BSA为抗原免疫BALB/c,取免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,制备杂交瘤细胞,以OVA-DON为检测抗原,采用问接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,使用有限稀释法进行阳性细胞亚克隆。结果表明,免疫小鼠血清效价最高为1：2000；筛选出1株稳定分泌IgG2a,轻链为λ链的DON杂交瘤细胞株。试验ⅢDON噬菌体单链抗体库的构建、筛选和原核表达以DON杂交瘤细胞为基因来源,利用设计引物,经RT-PCR扩增小鼠IgG的重链、轻链可变区基因,并通过(Gly4Ser)3多肽Linker拼接VL-Linker-VH,并扩增得到单链抗体ScFv基因片段。利用SfiI和NotI双酶切后连接ScFv基因和噬菌粒载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌E.coliTG1,经辅助噬菌体M13K07进行噬菌体拯救构建DON噬菌体单链抗体库。用DON检测抗原进行phage-ELISA,对噬菌体重组抗体进行免疫亲和、富集和筛选。结果表明,经过三轮富集后,富集倍数为144倍,抗体库滴度达到7.7×107cfu/mL。并筛选出一株DON特异性单链抗体的菌株。阳性噬菌体转染宿主菌E.coliHB2151后,通过诱导条件优化,发现其可溶性诱导温度确定为25℃,IPTG最佳诱导浓度为1.0mmol/mL,所表达的抗体蛋白大小约为35kDa。
【作者】黄星星；
【导师】孙卫东；
【作者基本信息】南京农业大学，临床兽医学，2013，硕士
【关键词】脱氧雪腐镰刀菌烯醇；单链抗体；噬菌体展示抗体库；筛选；表达；

【参考文献】
[1]吴丽顺.麦弗逊悬架建模仿真以及整车的操纵稳定性分析[D].东北大学,车辆工程,2010,硕士.
[2]刘鹏宇.智能交通系统中的车对车宽带无线信道建模[D].北京交通大学,通信与信息系统,2014,博士.
[3]周涛明.面向客户的产品定制设计平台研究及实践[D].浙江工业大学,2004.
[4]吴蓉.PTEN、iNOS、COX-2与胃癌的关系及临床意义[D].重庆医科大学,内科学,2004,硕士.
[5]吴娟.土地利用总体规划中土地利用现状与潜力分析[D].华中师范大学,2005.
[6]郭献崇.基于协同进化的聚类问题的研究[D].西安电子科技大学,计算机技术,2011,硕士.
[7]丁晨灿.贪污罪认定疑难问题研究[D].沈阳师范大学,法律,2014,硕士.
[8]米天胜.数据仓库和数据挖掘在客户关系管理中的应用[J].情报杂志,2005,09:18-20.
[9]马家驹.滚子凸度设计[J].轴承.1992(01)
[10]楚绪乾.对毛泽东文化观的哲学思考[D].山东师范大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[11]金忠华,李玉顺,张宗悦,杨素芳,陈祥林.激光在混合微电路外壳封焊中的应用[J].激光杂志.1984(03)
[12]谢方琴.我国食品安全法律规制存在的问题及对策研究[D].西南大学,民商法,2012,硕士.
[13]王礼光.郑州市服务业发展政策研究[D].郑州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[14]张国伟.陕西省榆林地区炕围画及其审美特点和艺术价值[D].内蒙古大学,艺术学,2013,硕士.
[15]周寅寅.“水清若空”纯露品牌开发与设计[D].山东工艺美术学院,艺术设计,2014,硕士.
[16]白冬梅.地方政府的环保责任问题研究[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[17]黄丽苹.在新《数学课程标准》指导下进行初中数学教学的研究与实践[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[18]王星.关联规则的序贯抽样算法比较研究[J].计算机工程与应用,2005,01:27-29+60.
[19]华木松,戎燕,王锡宁.医院经济立方体研究[J].医院管理论坛,2003,06:35-36.
[20]邹永根.胶原蛋白神经鞘管修复周围神经缺损的实验研究[D].重庆医科大学,骨外科,2014,博士.
[21]康沙沙.T1期声门区喉癌手术前后喉功能客观评估研究[D].山东大学,耳鼻咽喉科学,2013,硕士.
[22]樊婷婷.浅析先秦寓言对《说苑》的影响[D].西北师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[23]张白.研究CEA术的脑血流动力学变化及斑块稳定性[D].苏州大学,影像医学与核医学,2014,硕士.
[24]廖福涛.从功能视角评析小说《围城》中语码转换的人际意义[D].江西师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[25]郭晓娟.慢性个体化胃电刺激的参数筛选及其对犬摄食、体重、胃肠激素及胃排空的影响[D].北京协和医学院,内科学,2014,博士.
[26]申永东.对扩大消费拉动经济增长的思考[D].吉林大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[27]王旭峰.城市快速通道沥青面层的施工质量控制[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[28]乔彦飞.基于粗糙集的RBF网络设计方法的研究[D].东北大学,运筹学与控制论,2010,硕士.
[29]闾振华.高低压电器设备生产线建设项目的环境影响评估[D].西北农林科技大学,环境工程,2011,硕士.
[30]孙绚绚.中国著名古典吉他教育家陈志教授及其教学方法的初步探讨[D].中央音乐学院,古典吉他,2012,硕士.
[31]金晓宸.关于国际保理业务及其在我国开展问题的研究[D].东北财经大学,国际贸易学,2003,硕士.
[32]李铭钰.办公空间的概念设计研究[D].北方工业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[33]杨建国,周号,雷靖,高增梁.焊接应力与变形数值模拟领域的若干关键问题[J].焊接,2014,03:8-17+69.
[34]白珊珊.纳米ZnO材料制备及其光电化学性能研究[D].哈尔滨工业大学,信息功能材料与器件,2013,硕士.
[35]温丹.黑龙江省中北部两江地区铜矿的成矿条件与资源潜力分析[D].吉林大学,地质工程,2012,硕士.
[36]邸泽.区域技术创新与战略性新兴产业成长耦合发展研究[D].太原科技大学,产业经济学,2013,硕士.
[37]本报记者高靓.诺贝尔奖得主眼中的一流大学[N].中国教育报,2010-10-12003.
[38]江鹏.透氢V_(55)Ti_(30)Ni_(15)合金的制备工艺及组织性能研究[D].哈尔滨理工大学,材料学,2014,博士.
[39]胡锡.网络结构对企业模仿行为的影响研究[D].杭州电子科技大学,企业管理,2013,硕士.
[40]张吉纯.中铁建工集团北方工程有限公司战略发展分析与规划[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[41]韩宇.资源型城市转型过程中土地利用结构比较研究[D].沈阳师范大学,土地资源管理,2014,硕士.
[42]郑红梅.缺陷对纳米氧化锌光电性能影响的理论研究[D].燕山大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[43]卢洋.基于EVA的平安银行的投资价值分析[D].华东理工大学,会计（专业学位）,2013,硕士.
[44]解亚美.《中国青年报》与重点读者互动模式分析[D].山东大学,新闻学,2013,硕士.
[45]关小艳.唐宫廷女性出行研究[D].安徽大学,中国古代史,2014,硕士.
[46]刘莹.从生物基因原理研究地域绿色住居[D].浙江大学,2003.
[47]钱小磊.基于实验的镁合金本构模型及其在轧制数值模拟中的应用研究[D].吉林大学,2014.
[48]雷腾.虚拟人眼的运动与表情合成的研究[D].西南交通大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[49]张有为.人力资本、社会资本对大学生择业取向影响实证研究[D].扬州大学,劳动经济学,2012,硕士.
[50]刘思鸣.明代中期气学派心性观研究[D].华中师范大学,专门史,2013,硕士.