STAT3基因shRNA干扰对食管癌ECA109细胞促凋亡作用的研究

【摘要】食管癌是常见的恶性消化道肿瘤，在各种癌症死亡率居高。我国是世界上食管癌高发地区之一，且随着生活水平提高与生活方式改变有逐年上涨的趋势。传统治疗方法以手术为主，放、化疗为辅，尽管目前多种治疗技术的改进，总体5年生存率仍然很低，尤其对于晚期食管癌效果不甚理想。因此从基因角度治疗食管癌是近年来新兴的热点，为治疗食管癌打开一个新的思路。近年来许多研究报道了食管癌在基因水平上的发病机制。野生型p53为抑癌基因，但p53突变之后对于肿瘤细胞的免疫监视作用消失，成为许多癌症的病因，包括食管癌。抑癌基因p16与细胞周期的调控有密切关系，p16基因在食管癌细胞中发生杂合性丢失频率较高，突变后的p16基因不能竞争性抑制CDK4而导致cyclinD与CDK4结合，促进细胞增殖，发生癌变。c-myc基因的过度扩增与表达与细胞、组织的肿瘤发生、发展、演变有重要关系，相关研究在Barrett’s食管腺癌、食管基底细胞样鳞状细胞癌中都检测到c-myc的过度表达。信号转导子与转录激活子（STAT3）是一类细胞内DNA结合蛋白，在外界信号刺激下激活并且STAT能够直接将信号转入细胞核内引发相应靶基因的转录。在细胞的增殖、分化及凋亡过程中均有STAT3信号转导通路直接参与。以STAT为底物的JAK-STAT细胞信号转导途径对细胞的生长、增殖和转化都具有重要影响，该通路持续活化可导致细胞异常增殖并向恶性转化。STAT3活化并持续高表达导致纤维母细胞转化证明STAT3为一个原癌基因，已经有研究表明在人与鼠的多种恶性肿瘤如白血病、乳腺癌、肺癌及头颈部鳞状细胞癌中均有STAT3的过度活化与表达。许多研究都证实STAT3在多种恶性肿瘤中表达异常活跃，提示肿瘤的发生机制与STAT3的调控异常有密切关系，因此理论上在肿瘤细胞中阻断STAT3的信号转导通路有可能达到治疗肿瘤的作用。随着RNA干扰技术的发展，目前能够在基因水平沉默特定基因，使靶基因被剔除或沉默，目前RNA干扰技术广泛应用于探究特定基因功能或一些难治性疾病，尤其在肿瘤的治疗的领域RNA干扰有着十分看好的应用前景。目的：干扰食管癌ECA109细胞内JAK-STAT3信号转导通路，沉默STAT3基因表达，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。方法：针对STAT3基因，通过质粒载体携带小干扰RNA，应用真核细胞转染技术转染食管癌ECA109细胞，将携带有与STAT3的mRNA同源的小干扰RNA载体的pSliencer3.1-sh-stat3质粒与阴性对照pSliencer3.1-sh-scramble质粒转入食管癌细胞。通过Westernblot检测重组质粒及相关基因的蛋白水平的表达。通过细胞凋亡DNALadder检测试剂盒检测细胞凋亡早期标志物。使用线粒体膜电位检测试剂盒检测细胞凋亡早期的线粒体膜电位变化。应用Annexin-V-FITC凋亡试剂盒检测细胞早期凋亡与晚期凋亡。通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡峰。应用TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒检测细胞的凋亡程度。结果：实验证实重组质粒转入食管癌细胞后得到表达并发挥了预定作用。Westernblot结果显示，转染pSliencer3.1-sh-stat3质粒组Stat3表达明显降低，同时抑制了cyclinD1、c-myc蛋白的表达，活化型凋亡蛋白caspase-3减少，17KD大亚基cleavedcaspase-3蛋白明显增加。为证明重组质粒的分子生物学效应，进行了凋亡与细胞周期的检测。1.DNAfragmentation实验结果显示转染pSliencer3.1-sh-stat3质粒组出现明显的细胞早期凋亡标志物DNALadder。2.线粒体膜电位结果显示出转染24小时后出现细胞凋亡连级反应中最早期事件-线粒体膜电位去极化。3.Annexin-V-FITC凋亡试剂盒检测检测到早期凋亡与晚期凋亡达到35%，具有统计学意义。4.流式细胞术检测在正常二倍体细胞的G0/G1峰前出现亚二倍体峰即凋亡峰，且处于G0/G1期细胞数量显著增加，出现G0/G1期阻滞现象。5.TUNEL法检测凋亡结果显示基因组DNA发生断裂，重组质粒诱导肿瘤细胞发生凋亡，凋亡程度与流式细胞仪检测结果相符。本研究采用真核细胞转染方法，通过质粒载体，将于STAT3同源的小干扰RNA转入食管癌细胞中，靶基因STAT3表达量显著下降，成功干扰了细胞中JAK-STAT3信号转导通路，下游基因表达水平显著降低，细胞发生G0/G1期阻滞同时出现凋亡特征。综上所述在食管癌ECA109细胞中沉默STAT3基因能够达到抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡的效果，有可能成为未来治疗食管癌的新方法。
【作者】苏孟媛；
【导师】马杰；
【作者基本信息】吉林大学，生物医学工程，2014，硕士
【关键词】食管癌；RNA干扰；基因沉默；STAT3；凋亡；

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