羊口疮病毒感染宿主细胞的蛋白质组变化及功能分析

【摘要】羊传染性脓疱(contagiousecthyma)俗称“羊口疮”,是由痘病毒科,副痘病毒属羊口疮病毒(orfvirus,ORFV)引起的一种急性、高度接触性人兽共患传染病。该病主要侵害绵羊和山羊。临床上患病动物以口唇周围和乳房部位皮肤形成丘疹、水疱、脓疱和疣状痂皮为特征。该病发病率高,病死率低。羊传染性脓疱的暴发和流行不但严重危害肉羊产业的健康发展,而且威胁人们的身体健康。随着基因组测序技术的发展,多株羊口疮病毒的全基因组序列被测定,这为羊口疮病毒致病的分子机制研究提供了参考,但是基因组学技术研究只针对病原体自身,而不能反映病原体与宿主间的相互作用。目前利用蛋白质组学技术对ORFV和宿主细胞相互作用的研究未见相关报道。本研究以ORFV和山羊皮肤成纤维细胞(goatskinfibroblasts,GSFs)为研究对象,应用同位素标记相对和绝对定量联合二维液相色谱串联质谱技术(two-dimensionalliquidchromatography-tandemmassspectrometrycoupledwithisobarictagsforrelativeandabsolutequantification,iTRAQ-2D-LC-MS/MS)对ORFV感染GSFs后的蛋白组学变化,进行了探索研究和功能分析,期望能为人们了解羊口疮病毒与宿主细胞的相互作用研究提供参考信息,具体研究内容如下：1.羊口疮病毒囊膜蛋白(B2L)单克隆抗体(MonoclonalAntibodies,McAb)的制备参照GenBank上公布的ORFVB2L基因序列(GU320351)设计引物,应用PCR方法获得ORFVB2L基因全长,并将其定向连接到原核表达载体pET-30a上,在此基础上进行蛋白表达和纯化。以纯化后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用杂交瘤技术将免疫脾细胞和SP2/0细胞进行细胞融合,经过4次筛选和克隆,获得4株稳定分泌抗ORFVB2L蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为D1-B3,E4-C6,3-A11-2,B1-F3-A3。单抗亚类鉴定结果表明4株单抗的亚类均为IgG1,Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明4株单抗均能与羊口疮病毒发生特异性反应。2.羊口疮病毒在GSFs上的适应性和增殖特性研究将从患病羊痂皮病料中分离出的ORFV在GSFs上进行适应性培养,以探讨病毒在该细胞上的增殖特性。对GSFs首次接种ORFV后进行细胞病变观察和间接免疫荧光检测(indirectimmunofluorescentassay,IFA)。结果显示ORFV首次感染GSFs24h后开始有少量细胞出现肿胀和变圆,60h细胞开始脱落,72h病变完全。IFA结果显示接种ORFV的GSFs有特异性绿色荧光,表明ORFV能在GSFs内复制增殖。收集ORFV首次感染GSFs后不同时间点的病毒液进行病毒基因组拷贝数的Real-timePCR检测和TCID50测定,Real-timePCR检测结果显示感染后9h即可检测到病毒DNA,随感染时间延长病毒基因组拷贝数快速上升,72h达到最大(5.52×106copy/uL)。TCID50测定结果与病毒基因组拷贝数的增长趋势基本一致。在此基础上,将ORFV在GSFs上连续传至15代使其适应该细胞。结果显示随着传代次数的增多,细胞开始出现病变时间逐渐缩短,至10代后病变稳定。以第15代GSFs适应毒(CHINALuoyang2013)感染GSFs,感染后不同时间分别收集感染细胞和培养上清,利用Real-timePCR对不同样品的病毒DNA进行定量分析,绘制ORFV在GSFs上的一步法生长曲线。结果显示：感染后3h-35h,细胞内病毒DNA含量随感染时间延长而增加,之后因细胞裂解病毒DNA含量逐渐降低；细胞外病毒DNA含量呈“S型”曲线增长,感染后0h-11h为潜伏期,病毒含量维持在较低水平,第11h-43h为突破期,病毒DNA含量迅速增加,感染后43h-51h增长速度减慢,逐步进入稳定期。3.羊口疮病毒的遗传进化分析和ORF125蛋白的亚细胞定位利用DNAstar和MEGA4.0对ORFVGSFs适应毒株CHINALuoyang2013进行基于B2L基因的遗传进化分析,结果表明CHINALuoyang2013与2012中国疫苗株(JQ904789)同源性最高,处于同一进化分支。利用DNAstar和在线ExPASy工具对ORFVORF125蛋白与Bcl-2蛋白家族成员的氨基酸序列和二级结构进行比较分析,结果发现ORF125与Bcl-2家族蛋白一级结构同源性很低,但两者二级结构中α-螺旋位置和数量相似,推测它们也有着相似的三级结构,可能具备相同的功能。参考ORFVNZ2的ORF125基因序列(DQ184476)设计引物,利用常规分子克隆方法构建绿色荧光重组表达载体pEGFP-ORF125,瞬时转染GSFs后观察ORF125在GSFs中的定位情况,结果显示ORFV125蛋白主要在胞质中表达,在细胞核中仅有少量分布。4.羊口疮病毒感染宿主细胞的蛋白质组变化及功能分析以GSFs首次接种ORFV为感染模型,利用iTRAQ-2D-LC-MS/MS技术研究病毒感染细胞的全细胞蛋白质组表达变化。分别提取病毒感染53h后感染细胞和正常细胞的总蛋白,依次经烷基化,还原,酶解处理,iTRAQ标记和混合等过程,最后经液相色谱分离后再经串联质谱分析鉴定。质谱分析结果表明共鉴定到2776个蛋白,有282个蛋白发生差异表达,其中上调表达蛋白222个,下调表达蛋白60个。利用基因本体(GeneOntology,GO)数据库对这些差异表达蛋白进行GO注释和分类,结果发现差异表达蛋白几乎均匀处于细胞的所有组分中,主要参与细胞形态发生,蛋白合成,新陈代谢,免疫监视,外界刺激反应等过程；差异表达蛋白的分子功能包括结合、催化、分子转导、结构分子和酶调节等活性。蛋白相邻类的聚簇(ClusterofOrthologousGroups,COG)注释分类结果表明这些差异表达蛋白主要涉及翻译后修饰,蛋白折叠,分子伴侣,核糖体结构与生物合成,能量产生和转换,信号转导等功能。利用KEGG数据库对这些差异蛋白进行Pathway显著性富集分析,结果表明差异表达蛋白主要参与蛋白酶体,剪接体,糖酵解和糖新生途径,磷酸戊糖途径,过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activativedreceptors,PPAR)信号通路,NF-kappaB信号通路,雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)信号通路,β-TGF信号通路,内分泌和其他因素调节的钙吸收途径,抗原呈递途径,天然杀伤性细胞介导的细胞毒性作用途径,细胞内吞途径等。5.HSPA1B蛋白的亚细胞定位及其对ORFV增殖的影响选取差异表达蛋白HSPA1B构建绿色荧光重组表达载体pEGFP-HSPA1B,转染细胞后观察HSPA1B在GSFs中的亚细胞定位情况,结果显示HSPA1B蛋白弥散地分布在胞质中。在GSFs上过表达HSPA1B,然后用ORFV感染该细胞,并利用Real-timePCR检测病毒的增殖,分析HSPA1B蛋白对ORFV增殖的影响。结果表明在病毒感染早期阶段,HSPA1B不能抑制ORFV的细胞增殖；而在病毒感染的中期和末期阶段,HSPA1B能够显著抑制ORFV的增殖,HSPA1B蛋白抑制病毒增殖的功能主要发生在病毒感染的中后期。这一结果为HSPA1B蛋白在ORFV感染过程中的具体功能研究提供一些信息。
【作者】孔汉金；
【导师】吴斌；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】羊口疮病毒；单克隆抗体；增殖动力学；亚细胞定位；蛋白组学；

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