鱼类主要基质组分对药物残留酶联免疫吸附检测的影响

【摘要】免疫检测具有简单、快速、特异性强、灵敏度高等优点，这些优点也使得免疫检测非常适用于样品的常规检测。然而，免疫检测过程中一个最为基本的问题就是样品或样品提取物中极其复杂多变的蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子所产生的影响。目前针对水产品中基质效应的研究还较少，对其机理的研究则几乎没有。因此，本论文旨在找到水产品中药物残留免疫检测过程中最主要的干扰基质，并探究这种干扰作用的机理，为建立简便有效快速的酶联免疫吸附检测方法提供一定的理论依据。本论文首先以三种典型鲆鲽鱼（大菱鲆、牙鲆、舌鳎）为主要研究对象，研究探讨水产品中药物残留免疫检测过程中最主要的干扰基质组分，分析免疫检测过程中的基质干扰来源。通过竞争性酶联免疫吸附检测（ci-ELISA）和免疫印迹手段判断鱼肉蛋白干扰免疫检测过程机理，以及这种干扰作用存在的普遍性。随后，以牙鲆鱼为代表，实现了对其中两种主要蛋白的分离纯化和性质的研究。主要结果如下：1.三种鲆鲽鱼中主要干扰基质组分的识别和判断：发现三种鲆鲽鱼类的粗提溶液和经凝胶过滤层析去除其他小分子基质得到蛋白质溶液均能对诺氟沙星ci-ELISA检测过程产生较大的影响(P<0.05)，证明蛋白质组分是鱼类免疫检测过程中的主要干扰组分；鲆鲽鱼中部分金属离子种类的含量变化和酸性环境（pH为2-5）也能对免疫检测过程产生显著影响。在一定的离子强度(0.02mol/L~0.50mol/L)范围内，诺氟沙星ci-ELISA抑制率结果与样品溶液中离子强度的变化有极强的线性相关性。2.免疫印迹和ci-ELISA手段判断鱼肉蛋白干扰免疫检测过程中机理：免疫印迹结果表明鱼肉中的某些蛋白质与免疫球蛋白IgG存在非特异性作用，这种作用可能是蛋白质干扰免疫检测的重要来源；来自于三种鲆鲽鱼中的35kD45kD间的蛋白质以及大菱鲆中的16kD蛋白能够和多种免疫球蛋白（包括IgG和IgE）发生普遍性的非特异性相互作用；ci-ELISA结果显示，鲆鲽鱼中这些蛋白质与二抗的作用要强于其与一抗的相互作用，进一步阐明了鱼肉蛋白干扰免疫检测过程的机理。3.水产品免疫检测基质效应存在的普遍性验证：蛋白质与免疫球蛋白的作用在五种不同来源的鱼虾中均存在；通过不同的提取方法对比，发现蛋白质在酸性、碱性以及某些有机溶剂（如甲醇）的存在下能够较为有效的溶出，且能够与抗体发生非特异性结合。说明水产品免疫检测过程基质效应是一种普遍现象。4.实现了对牙鲆鱼中干扰蛋白质的分离纯化及性质研究：硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析方法分离出了牙鲆鱼肉中两种主要的干扰蛋白质36kD和42kD蛋白，达到了电泳纯级别，并通过免疫印迹方法确认验证，分离得到的干扰蛋白对诺氟沙星ci-ELISA均有着显著的影响。两种蛋白的主要性质概括如下：a)干扰蛋白质的等电点为8左右，为碱性蛋白；b)当pH≤5时，42kD干扰蛋白易发生变性沉淀，36kD干扰蛋白在pH3-11范围内较为稳定；c)两种蛋白的热稳定性均较差，60℃的水浴加热均可以两种蛋白变性沉淀；d)这两种蛋白均具有很好的离子强度稳定性。这些性质可以为前处理过程pH值、离子强度、温度的选择提供指导。本研究实现了酶联免疫检测中主要干扰基质组分的识别、判断，并对主要的干扰机理进行了探究，发现了鱼肉蛋白与免疫球蛋白之间的普遍作用，实现了对主要干扰蛋白的分离纯化和性质研究，填补了国内外水产品免疫检测过程中的基质效应和相应机理研究的空白，减少和避免了前处理过程的盲目性，为开发有效简便的基质效应消除方法和简化前处理过程提供理论依据。
【作者】王秀丹；
【导师】林洪；曹立民；
【作者基本信息】中国海洋大学，食品科学，2014，硕士
【关键词】鱼类；基质组分；药物残留；酶联免疫吸附检测；蛋白质；离子；干扰机理；

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