内含肽介导的重组酶Cre拆分及其在拟南芥中的删除活性研究

【摘要】近年来,植物转基因技术的研究和开发取得了巨大进展,但同时也存在一些不容忽视的问题,其中对转基因作物的安全性评价问题更是成为国际社会广泛关注的焦点。转基因技术可能带来的生物安全性问题,俨然已经成为将转基因作物推广应用的主要障碍,一些生物技术手段己先后应用于转基因作物生物安全隐患控制当中,其中能高效并彻底地删除转基因植物中外源基因的基因删除系统”Gene-deletor”,为转基因作物生物安全隐患问题的解决提供了一个重要思路,但是该系统却不能应用于杂交作物育种中。为获得一个可用于杂交作物的高效基因删除系统,本研究对”Gene-deletor”系统进行改良,通过该系统所依赖的位点特异性重组酶Cre进行拆分,即将有重组活性的Cre蛋白拆分为没有活性的N端和C端多肽片段,然后把这两段无活性的多肽片段分别置于亲本中,通过人工杂交技术,使得杂交子代中同时含有重组酶Cre的两段多肽,而拆分后的Cre蛋白的N端和C端在蛋白内含肽Intein的介导下恢复了重组酶Cre的部分活性,为建立起一个可用于杂交作物育种的基因删除系统,实现生产安全转基因产品的目标奠定基础。主要结果如下：一、拆分位点的选择。通过对重组蛋白Cre高级结构的分析,结合前人的研究工作,共选择了五个拆分位点,分别为第384bp、629bp、740bp、866bp和1013bp,即从Cre蛋白氨基酸序列的第128、153、190、232和281位点处将其拆分,其中第384bp位点处于Cre蛋白的结构域里,其余4个位点则处于Cre蛋白结构域之间的连接区域。二、不同拆分位点删除效率的比较。以植物表达载体pCAMBIA1305.1为基本骨架,在已构建的载体pCA-Loxp的基础上,将相应目的片段连接上,得到五个拆分载体,即pCA-CRE384、pCA-CRE629、pCA-CRE740、pCA-CRE866、pCA-CRE1013。通过发根农杆菌C58C1转化模式植物烟草,初步检验拆分蛋白的重组活性,并统计了5个载体的删除效率,结果发现,Cre384这个作为阴性对照的拆分载体不能使烟草发根染为蓝色,而Cre629、Cre740、Cre866、Cre1013这四个位点的拆分载体,均能使毛状根染成蓝色,GUS染色阳性率分别为20%、18.5%、31.3%、30.8%。三、拆分系统在拟南芥中的删除活性分析。根据五个拆分位点载体烟草发根的删除效率研究,进一步选择Cre866作为最佳拆分位点,通过根癌农杆菌EHA105转化拟南芥,经T2代筛选后,共获得6株拟南芥单拷贝转基因植株,进行GUS染色分析,并分别提取不同转基因株系的GUS蛋白,用荧光分光光度计法定量测定了叶片中GUS蛋白的表达活性,结果发现,不同转基因株系拟南芥GUS染色蓝色程度各有差异,随着蓝色程度的加深,GUS蛋白的活性越高。四、杂交方法验证拆分系统的删除活性。将内含肽介导的分别含Cre蛋白N端和C端的杂交系统载体转化拟南芥,经T3代自交筛选获得转基因拟南芥单拷贝纯合体,将其作为亲本进行人工杂交,获得杂交子代,通过GUS染色发现,只单独含有Cre蛋白N端和C端的亲本拟南芥均不能被染成蓝色,而杂交子代则全部被染为不同程度的蓝色,说明在蛋白内含肽intein的介导下,Cre蛋白恢复了部分重组活性并发生了删除作用。
【作者】付夏楠；
【导师】罗克明；
【作者基本信息】西南大学，植物学，2014，硕士
【关键词】重组酶Cre；基因删除；蛋白拆分；蛋白内含肽；生物安全；

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