微生物催化肉桂醛、肉桂醇和潜手性芳香酮的反应研究

【摘要】肉桂是广西重要的林业资源,其主产区为广西十万大山南麓和西江流域。广西肉桂产量占全国60%以上,桂油产量占全国90%。肉桂广泛应用于食品和医药等领域,其挥发油(肉桂油)是重要的天然香料之一。本论文以肉桂皮提取挥发油后所余残渣即肉桂渣、肉桂油的主要成分肉桂醛,肉桂醛的衍生物肉桂醇及潜手性芳香酮为起始底物,开展了一系列的微生物催化反应研究。主要研究内容和取得的成果如下：1.肉桂渣生物降解制备肉桂酰胺及其工艺研究。肉桂皮提取肉桂油后的固体物渣通常作为肥料或废弃物排放,没有得到有效利用。为此,本文开展了微生物降解肉桂渣的研究为综合利用肉桂皮资源提供参考。从土壤中筛选获得了1株能将肉桂渣中部分成分转化为肉桂酰胺的菌株CG19,它能使肉桂渣降解制备肉桂酰胺。首先进行了菌株CG19的鉴定,该菌株经过ITS序列与NCBI数据库进行对比,被鉴定为链霉菌(Streptomycessp.),命名为Streptomycessp.CG19。然后进行了CG19培养条件优化,优化结果是：CG19在以30g·L-1麦芽糖为碳源,10g·L-1硫酸铵为氮源,pH为5.0,30℃的条件下培养72h,所得湿菌体质量最大。最后进行了肉桂渣降解条件的优化,工艺优化条件是：肉桂渣8.0g·L-1,湿菌体40g·L-1,无水乙醇30mL·L-1,100mLpH为5.0的磷酸盐缓冲溶液,30℃下反应3d。肉桂酰胺的收率为0.32%。2.肉桂醇生物转化制备3-苯丙醇的菌株筛选及其工艺优化。从特殊土壤中筛选到一株可催化肉桂醇生成3-苯丙醇的微生物菌株CG10,经过16SrDNAPCR扩增和序列测定,将菌株CG10鉴定为毛霉菌(Mucorsp.),并把该菌株命名为Mucorsp.CG10。肉桂醇生物转化制备3-苯丙醇的优化条件是：在糊精质量浓度为30g·L-1,蛋白胨质量浓度为16g·L-1,100mLpH为5.0的发酵培养基,30℃下培养72h,分三次加入底物肉桂醇。肉桂醇的初始加入量为2mL·L-1反应24h,二次加入量为0.5mL·L-1反应8h,三次加入量为0.5mL·L-1反应16h,Mucorsp.CG10催化肉桂醇的转化率为99%,反应生成3-苯丙醇的选择性为92%,转化液中3-苯丙醇的最高产量可达2.9g·L-1。较优化前的产量1.3g·L-1提高了123%。3.微生物催化肉桂醛的还原反应及其工艺优化。证明了微生物还原肉桂醛时优先生成肉桂醇,之后再进一步还原生成3-苯丙醇。(1)采用富集培养方式对土壤中的菌株进行了大量耐受肉桂醛的筛选筛选,得到7株能将肉桂醛选择性加氢生成肉桂醇的菌株(肉桂醛转化率>20%),其中菌株CG08的转化能力最强。16SrDNAPCR扩增和序列测定结果表明,菌株CG08为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)。并把该菌株命名为CitrobacterfreundiiCG08。CG08催化肉桂醛还原制备肉桂醇的优化条件是：在葡萄糖为碳源,蛋白胨为氮源,100mLpH为6.0的发酵培养基,30℃下培养72h,分两次加入底物肉桂醛。肉桂醛的初始加入量为2.0mL·L-1、反应40h,二次加入量为1.0mL·L-1,反应32h,肉桂醛的转化率为100%,反应生成肉桂醇的选择性为90%,转化液中肉桂醇的最高产量可达2.9g·L-1。CG08能高效、高选择性的将肉桂醛还原为肉桂醇,但是不能将肉桂醇继续还原为3-苯丙醇。(2)进行了菌株Mucorsp.CG10还原肉桂醛的研究。优化条件是：在糊精质量浓度为20g·L-1,蛋白胨质量浓度为2.0mL·L-1,pH为5.0的100mL发酵培养基中培养72h,加入2mL·L-1肉桂醛,反应27h。肉桂醛转化率为92%,生成肉桂醇的选择性为88%。若再向转化液中添加24mL·L-1Mucorsp.CG10湿菌体,此时的产物肉桂醇将继续被还原为3-苯丙醇。反应结束后转化液中3-苯丙醇的浓度达到1.9g·L-1,整个反应,肉桂醛的转化率为100%,3-苯丙醇的选择性为86%,只余少量的肉桂醇未被还原。结果表明,通过两步反应,Mucorsp.CG10能高效的将肉桂醛还原为3-苯丙醇。4.Mucorsp.CG10不对称还原潜手性芳香酮合成相应手性(S)-芳香醇研究。并探讨了取代基的性质对反应转化率、e.e.值及微生物对反应底物的耐受性的影响。合成方法是：Mucorsp.CG10在以糊精为碳源,蛋白胨为氮源,培养pH为5.0,培养温度为30℃的100mL发酵培养基中培养72h得到发酵液,将发酵液抽滤得到湿菌体。将24g·L-1湿菌体放入100mLpH为4.0的磷酸盐缓冲溶液中,加入20g·L-1葡萄糖作为辅助底物,再分别加入20mM苯乙酮及其9种芳环取代物,在30℃,180r·min-1,反应3d,分别生成对应的(S)-型手性芳香醇。反应的转化率在52～99%范围内,e.e.值在38～99%范围内。芳香酮苯环上的取代基对转化率、e.e.值及微生物对反应底物的耐受性均有显著影响。对于对位卤代苯乙酮而言,随着取代基F-、C1-、Br-和I-吸电子效应的降低,反应的转化率依次降低,而产物的e.e.值依次增加。
【作者】张笮晦；
【导师】刘雄民；
【作者基本信息】广西大学，化学工艺，2014，博士
【关键词】生物催化；肉桂渣；肉桂醛；肉桂醇；3-苯丙醇；手性合成；潜手性芳香酮；手性芳香醇；

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