脂联素对脓毒症大鼠的肺保护作用及其机制研究

【摘要】第一部分脂联素对脓毒症大鼠肺损伤及炎症介质的影响目的：探讨脂联素(APN)对脓毒症大鼠肺损伤及炎症介质的影响。方法：采用CLP法建立脓毒症模型。雄性Wistar大鼠54只,随机分为对照组(C组)、脓毒症模型组(CLP组)、APN预处理组(APN组)。各组随机抽取8只大鼠行5天生存率分析。APN组于CLP前12hi.p.APN(6mg/kg)。CLP后动脉血气分析、测定血浆TNF-α、IL-6、HMGB1水平及血清ALT、AST、BUN、Cr、CK浓度；测定肺W/D比值,观察肺组织病理变化及肺损伤病理学评分；检测肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白含量、白细胞总数和分类以及TNF-α、IL-6水平；检测肺组织MPO、SOD及HMGB1mRNA水平。结果：1、与C组比较,CLP和APN组大鼠5天生存率和血气Pa02均下降(P<0.05)；血浆TNF-α、IL-6和HMGB1水平及血清生化指标均升高(P<0.05)；肺W/D比值、肺损伤病理学评分升高(P<0.05);BALF中蛋白含量、白细胞总数和PMN%及TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05)；肺组织SOD活性下降(P<0.05),MPO活性和HMGB1mRNA水平表达均升高(P<0.05)。2、与CLP组比较,APN组大鼠5天生存率及血气PaO2升高(P<0.05)；血浆TNF-α、IL-6和HMGB1水平及血清生化指标降低(P<0.05)；肺W/D比值、肺损伤病理学评分均下降(P<0.05);BALF中蛋白含量、白细胞总数和PMN%及TNF-α、IL-6水平均下降(P<0.05)；肺组织SOD活性升高(P<0.05),MPO活性及HMGB1mRNA水平均有所下降(P<0.05)。结论：APN通过减少肺水含量,减轻肺病理损伤程度,抑制中性粒细胞聚集,提高脓毒症大鼠生存率,抑制炎症因子的释放,对脓毒症大鼠肺损伤具有保护作用。第二部分脂联素通过IL-6及JAK2/STAT3信号转导通路影响脓毒症大鼠肺损伤的研究目的：观察脂联素是否通过抑制IL-6/JAK/STAT通路中的作用位点发挥对脓毒症大鼠肺组织的保护作用。方法：选用120只雄性Wistar大鼠,随机分为：对照组(C组)、脓毒症模型组(CLP组)、脂联素组(APN组)、脂联素+抗IL-6单克隆抗体组(APN+ANTI-IL-6组)、脂联素+雷帕霉素组(APN+RPM组)。APN组、APN+ANTI-IL-6组及APN+RPM组于CLP前12hi.p.APN(6mg/kg)。APN+ANTI-IL-6组大鼠于CLP前1hi.p.ANTI-IL-6(0.5mg/kg)。APN+RPM组于CLP前1hi.p.RPM(0.4mg/kg)。各组随机抽取8只大鼠行5d生存率分析。CLP后各组随机抽取10只大鼠进行肺组织病理学检查,测定各组肺W/D比；肺组织MPO活性；使用ELISA测定血浆TNF-α、IL-6和HMGB1水平；使用EMSA测定肺组织STAT3DNA结合活性；Real-timePCR测定肺组织TLR4mRNA及HMGB1mRNA表达水平。结果：1、与C组比较,CLP组、APN组、APN+ANTI-IL-6组、APN+RPM组大鼠5d生存率降低(P<0.05),血浆TNF-α、IL-6和HMGB1水平显著升高(P<0.05),肺损伤病理学评分、肺组织W/D比、MPO活性、STAT3DNA结合活性以及TLR4mRNA、HMGB1mRNA水平在CLP后均增加(P<0.05)。2、与CLP组比较,APN组和APN+RPM组5d生存率升高(P<0.05),APN组、APN+ANTI-IL-6组、APN+RPM组血浆TNF-α、IL-6和HMGB1水平,肺损伤病理学评分、肺组织W/D比、MPO活性、STAT3DNA结合活性、TLR4mRNA水平以及]HMGB1mRNA水平均降低(P<0.05)。3.与APN组比较,APN+ANTI-IL-6组和APN+RPM组5d生存率降低(P<0.05)。APN+ANTI-IL-6组、APN+RPM组血浆TNF-α、IL-6和HMGB1水平、肺损伤病理学评分、肺W/D比、MPO活性、STAT3DNA结合活性以及TLR4mRNA、HMGB1mRNA水平均增高(P<0.05)。结论：脂联素通过抑制脓毒症大鼠IL-6及STAT3的表达,影响脓毒症肺损伤及炎症反应。给予ANTI-IL-6及RPM干预后脓毒症大鼠肺组织STAT3和TRL4mRNA表达水平升高,炎症反应及肺损伤加重。提示脂联素的肺保护作用可能与抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路有关。第三部分脂联素介导IL-10/HO-1信号转导通路影响脓毒症大鼠急性肺损伤及机制研究目的：研究IL-10/HO-1信号转导通路在脂联素影响脓毒症大鼠急性肺损伤中的作用,探讨脂联素肺保护的可能分子机制。方法：采用CLP法建立脓毒症模型。100只雄性Wistar大鼠,随机分为对照组(C组)、脓毒症模型组(CLP组)、APN预处理组(APN组)、IL-10预处理组(IL-10组)和ZnPPⅨ干预组(Zn组)。APN组于CLP前12hi.p.APN(6mg/kg),Zn组于APN前12hi.p.ZnPPⅨ(10mg/kg),IL-10组在APN前30mini.p.IL-10(1μg/kg)。各组随机抽取10只大鼠进行5天生存率分析。CLP后动脉血气分析,测定肺W/D比,HE染色观察肺组织病理变化及肺损伤病理学评分；检测BALF中总蛋白含量、白细胞总数和分类以及TNF-α、IL-6水平；检测肺组织MPO、SOD活性及IL-10、HO-1蛋白表达。结果：1、与C组比较,CLP组、APN组和Zn组大鼠5d生存率及血气PaO2均下降(P<0.05)；肺W/D比、肺损伤病理学评分均升高(P<0.05)；BALF中蛋白含量、白细胞总数和PMN%及TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05)；肺组织SOD活性下降,MPO活性升高(P<0.05)。IL-10组上述指标及生存率与C组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2、与CLP组比较,APN组、Zn组和IL-10组血气Pa02均升高(P<0.05)；肺W/D比、肺损伤病理学评分均下降(P<0.05);BALF中蛋白含量、白细胞总数和PMN%及TNF-α、IL-6水平均下降(P<0.05)；肺组织SOD活性升高,MPO活性下降(P<0.05)。3、与C组比较,CLP组、APN组、IL-10组和Zn组肺组织IL-10和HO-1蛋白表达水平升高(P<0.05)；其中APN组和IL-10组肺组织IL-10和HO-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)4、与APN组比较,Zn组血气Pa02下降(P<0.05)；肺W/D比、肺损伤病理学评分均升高(P<0.05)；BALF中蛋白含量、白细胞总数和PMN%及TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05)；肺组织SOD活性下降(P<0.05),MPO活性升高(P<0.05)。而IL-10组血气Pa02升高(P<0.05)；肺W/D比、肺损伤病理学评分均降低(P<0.05)；BALF中蛋白含量、白细胞总数和PMN%及TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.05)；肺组织SOD活性升高,MPO活性降低(P<0.05)。结论：1、APN通过上调脓毒症大鼠肺组织IL-10、HO-1蛋白表达,减少肺水含量,减轻肺病理损伤程度以及炎性反应,保护脓毒症大鼠肺组织。而HO-1抑制剂ZnPPIX能够部分逆转APN的上述肺保护作用。2、预先给予外源性IL-10,APN可明显提高脓毒症大鼠肺组织HO-1表达及生存率,降低炎性因子及肺损伤,表明APN的肺保护作用可能与IL-10/HO-1通路有关。
【作者】鲍红光；
【导师】杨建平；
【作者基本信息】苏州大学，麻醉学（专业学位），2014，博士
【关键词】脂联素；脓毒症；肺损伤；JAK2/STAT3；血红素氧化酶-1；

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