核酸分子折叠机制的模拟研究

【摘要】核酸是生命体内的基本物质。在传统的中心法则中,DNA是遗传信息的主要载体,储存着生物体的遗传基因；以DNA为模板,生命体通过转录过程可以合成RNA；最后,转录形成的RNA在核糖体中翻译成为蛋白质,为生命活动提供必需的物质。随着对核酸分子研究的深入,中心法则也逐步完善。比如,研究发现RNA在逆转录酶的协助下可以做为模板逆转录DNA、RNA也可以以自身为模板进行复制等等。需要特别指出的是,近年来对非编码RNA的研究极大地丰富了我们对RNA功能的认识。非编码RNA是指不能翻译为特定蛋白质的RNA分子。小的非编码RNA包含20-500个核苷酸残基不等,而长的非编码RNA则可以由几千甚至上万个核苷酸残基组成。这些非编码RNA有着极其重要的作用,涉及到转录调控、染色体复制、RNA的加工和修饰、mRNA的稳定和翻译、甚至蛋白质的转运等等。这些都突出地表明了核酸分子在生物遗传变异中的重要性。因此,对核酸分子的深入研究会给人类进一步探索生命过程带来极大的帮助。核酸分子的折叠机制便是该研究领域中重要的一部分。同蛋白质一样,核酸分子在实现其生理功能时,也会形成一定的结构来做支撑。比如,DNA在复制时,启动子通常会与蛋白质结合来完成复制的起始阶段,这时候DNA需要形成一定的空间结构来帮助其与蛋白质结合；端粒是染色体末端的DNA单链,为了防止染色体被降解,端粒通常也会形成特定的三维结构以起到保护作用；RNA在结合蛋白质或者行使其它生理功能时,也会形成稳定或亚稳定的空间结构。研究核酸分子如何折叠并形成特定空间结构的过程,可以帮助我们更深入地了解这类生物大分子在生命过程中的作用。另外,能量面理论在蛋白质分子研究领域已经被广泛认可,研究核酸分子折叠的机制可以帮助我们验证这种理论在其它生物大分子研究中的适用性。在研究和分析核酸分子的折叠机制时,分子动力学模拟是一条非常有效的途径。分子动力学模拟是广泛应用于生物物理、生物化学、固体物理等领域中研究庞大复杂体系的一种方法。分子动力学,尤其是基于全原子模型的分子动力学,可以获取所研究系统清晰的动态变化过程和热力学统计信息,同时也可以作为实验方法所获信息的一种有效补充。但是,经典的分子动力学模拟方法也存在一定限制。一般来说,分子体系的能量面上存在大量的能量局域极小区域,模拟过程常常会长时间限制在这些局域极小区域内进行局部采样,导致在可接受的模拟时间内不能搜索到全局极小,或不能对相空间进行充分采样。现阶段,人们主要通过发展各种采样方法、提高采样水平来解决此类问题。其中,常用的采样方法包括伞形抽样(umbrellasampling)、副本交换(replicaexchangemoleculardynamics)、Metadynamics以及转变路径采样(transitionpathsampling)等等。虽然这些方法都有着各自的优势,并且在研究某些问题时都取得了不错的效果,但在应用到复杂的生物系统中时,它们的准确性还需要进一步验证。本论文在核酸分子的折叠机制以及分子动力学采样方法方面做了如下几个工作。首先,我们研究了模拟核酸折叠机制所应使用的方法问题。目前模拟生物物理体系自由能面的手段中,比较有效和常用的是Metadynamics方法及其众多变种。但是这些方法的准确性和有效性从来没有在生物大分子体系中得到过严格的测试,人们对其适用范围并不清楚,这导致了事实上的一定程度的混乱。在这里,我们利用简化模型(Go模型),通过对C12蛋白质体系的模拟采样,研究和分析了Metadynamics及其变种方法的可用性和准确性。我们的模拟结果表明,经典的Metadynamics方法有着很高的采样效率,并且能得到自由能面的大致形貌,但是所得自由能的具体数值不准确。Well-temperedMetadynamics方法可以很好的解决经典Metadynamics方法收敛性的问题,并且如果参数选择合适,可以得出比较准确的结果。然而,一些重要参数的选取是一个非常困难的问题。这导致这一方法实用性不高。Metadynamics结合副本交换的方法(BiasexchangeMetadynamics)的结果最好,其中从没有加偏置的副本中得到的结果最为理想。通过这一工作,我们澄清了多个模拟方法的有效性和局限性,找到了它们各自的合理的参数空间,积累了经验,这为进行下面的研究工作打下了基础。在上面研究工作的基础上,我们运用副本交换的Metadynamics方法(BiasexchangeMetadynamics)着重研究了两个核酸分子体系的折叠机制：DNAG-quadruplex结构和RNA赝结(pseudoknot)结构。G-quadruplex是富含鸟嘌呤(G)的核酸序列通常会形成的一种结构。这种结构经常存在于端粒当中。端粒是染色体末端富含TTAGGG重复片段的DNA序列,主要可以起到保持染色体完整性、保护染色体不被降解以及防止染色体相互融合等作用。此外,研究表明,端粒中的G-quadruplex结构可以抑制端粒酶的活性,而活化的端粒酶在大多数癌细胞中都扮演着重要角色。因此,研究端粒中G-quadruplex的结构特性可能为研制抗癌药物的研究提供重要信息。在本工作中,我们结合BiasexchangeMetadynamics采样方法和常规分子动力学模拟来研究人端粒内hybrid-1型G-quadruplex的折叠机制。利用BiasexchangeMetadynamics方法,我们得到了体系的自由能面信息并观察到四个折叠中间态,包括一个G-triplex中间态和一个类似于天然结构的中间态。然后,我们应用常规分子动力学模拟分别研究了这些中间态的稳定性和结构特性。在上面模拟工作的基础上,我们得到了如下有创新性的结果。首先,基于大规模的模拟计算,我们首次给出了G-quadruplex的完整的、原子级分辨率的折叠路径和折叠机制,相比较而言,前人实验和模拟工作只能给出大致的或片段式的描述。其次,我们深入研究了G-quadruplex的折叠过程和金属离子结合之间的关系,这为人们理解金属粒子参与生物分子的结构形成过程提供了丰富的信息。再次,我们还研究了糖苷键的顺式反式异构对折叠的影响,这样的工作是不多见的。最后,我们还讨论了非天然相互作用在折叠过程中所起的作用,发现其可以通过限制搜索空间来加速折叠过程。赝结(pseudoknot)是RNA(包括非编码RNA)中一种常见的结构,在基因的转录和表达过程中都会起到重要作用。比如,研究发现赝结结构可以通过frameshifting机制协助同一条mRNA序列翻译出不同的蛋白质。在赝结中,既有二级结构又有三级结构,同时包含了正则、非正则碱基相互作用等比较受关注的问题,所以赝结结构是研究RNA折叠机制以及其它性质的一种非常好的体系。此外,由于赝结结构中loop存在较大的柔性,使得这种结构成为RNA结构预测中非常困难也很热门的一个问题。在这一研究工作中,基于BiasexchangeMetadynamics方法,我们对T2噬菌体中的一个mRNA赝结结构进行了研究。通过模拟采样以及对自由能面的分析,我们得到了如下有创新性的结果。首先,我们刻画了中间态的具体结构,发现了非天然相互作用在折叠过程中的重要作用。其次,我们在验证了折叠路径多样性的同时,也发现了两个发夹折叠的协作性在整个赝结折叠过程中的存在。最后,我们讨论了loop在折叠过程中重要的协助作用,这在以前的研究中是没有描述过的。我们的这些结果极大地丰富了人们对赝结折叠机制的研究,是对以前研究工作很好的补充。本论文内容安排如下：第一章中,将着重介绍DNA和RNA的基本结构特征和热力学、动力学基础以及Metadynamics和它的变种采样方法；第二章中,将介绍利用简化模型对Metadynamics及其变种采样方法的准确性进行测定的工作；在第三章中,会介绍采用BiasexchangeMetadynamics以及常规分子动力学模拟对DNAG-quadruplex结构折叠机制研究的工作；第四章中,将介绍采用BiasexchangeMetadynamics研究RNA赝结结构折叠机制的工作；最后,在第五章中,将对本论文进行总结,并对未来的工作进行展望。
【作者】边运强；
【导师】王炜；张建；
【作者基本信息】南京大学，物理学（专业学位），2014，博士
【关键词】分子动力学模拟；Metadynamics；G-quadruplex结构；赝结结构；

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