小麦对白粉病感病性基因筛选与功能分析

【摘要】小麦是世界上重要的粮食作物之一,白粉菌是小麦等经济作物的主要病害。小麦白粉病菌的快速变异导致小麦品种抗病性丧失,不能持久。目前,中国已经鉴定出40多个小麦白粉病抗病基因,而分离克隆的只有Pm3,要逐个克隆这些基因并把它们集中到一个品种上,可谓任重道远。以往研究表明活体病原菌的成功侵染、定殖和发育需要一些寄主感病因子的参与；感病性基因功能缺失突变后,植物获得了广谱抗病性。感病性基因的研究为植物抗病性的改良提供了一个新的途径。但目前尚缺乏小麦对白粉病感病性相关基因的研究。为此,本研究利用cDNA芯片杂交技术对不同抗病性小麦与白粉病菌互作的基因表达群谱进行了分析,并进一步运用单细胞瞬间表达技术鉴定了3个潜在的小麦感白粉病基因。主要结果如下：1.组织学和细胞学观察结果表明,病原菌接种豫麦13后,吸器形成比率很高,表现高感；红蚰麦和齿牙糙麦表现出抗病；其抗性机制包括乳突抗性和过敏性反应两个方面。2.提取不同抗性小麦与白粉菌互作过程中的总RNA,进行cDNA芯片杂交；通过对基因芯片数据的综合分析,筛选出了11个候选感病性基因。这些基因在感病品种中接种前后具有非常高的表达量,但在抗病品种中几乎不表达。实时荧光定量PCR验证表明cDNA芯片杂交数据是可靠的。随后构建了这些基因的干扰表达载体,进行了基因枪介导的单个小麦表皮细胞的基因干扰实验和抗病性变化测定。沉默实验表明,有3个具备感病性基因的特征,另外8个基因没有感病性基因的作用甚至部分有相反的作用。3.试验确定了其中两个感病性基因属于长链非编码RNA,对应的EST登陆号分别为BQ168479,CA648596,将其命名为TaSl和TaS2(Triticumaestivumsusceptibility,TaS).在现有基因沉默技术水平下,能够使小麦的抗病性分别增强22%和15%。进一步通过RACE实验克隆该基因全长。荧光定量PCR检测这两个基因在感病小麦不同器官中的表达量存在明显差异,且受白粉菌的接种诱导表达,在白粉菌附着胞初侵染时期起作用。基因比对分析没有发现其它植物中存在这两个基因的同源序列。4.另一个感病基因TaS3(Accession.no.BG909123),在单细胞瞬间表达沉默后小麦抗病性增强19%；并通过5’RACE获得基因全长,过量表达TaS3后小麦感病性增强14%；TaS3编码的蛋白酶与SUMO特异性蛋白酶(ULP1)同源,能够编码381个氨基酸；根据合成的全长cDNA片段与GFP连接构建表达载体,农杆菌侵染烟草进行亚细胞定位研究,明确该蛋白定位于细胞核；荧光定量PCR分析表明,TaS3在感病小麦接菌后12h显著上调,说明TaS3蛋白酶含量增多,可能通过直接调控SUMO化进程,促进了白粉菌的侵染。
【作者】李绍慧；
【导师】王政逸；胡东维；
【作者基本信息】浙江大学，植物病理学，2013，博士
【关键词】感病基因；小麦；白粉病菌；芯片杂交；RNA干扰；瞬间表达；过量表达；

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