帕病2号方对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护机制

【摘要】目的：1.神经毒性物质6-OHDA左侧纹状体两点注射法建立帕金森病(Parkinsondisease,PD)大鼠模型,检测术后不同时间点大鼠左侧纹状体组织内多巴胺(dopamine,DA)和乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)含量的变化及大鼠行为学变化。术后不同时间点检测大鼠左侧中脑黑质组织转录因子NF-E2(nuclearfactor-erythroid2-relatedfactor2,Nrf2)核蛋白、血红加氧酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)蛋白的表达。2.研究帕病2号方对PD大鼠中脑黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用及其机制,为帕病2号方的临床应用提供实验研究基础。方法：实验一：雄性SD大鼠,随机分为假手术组和6-OHDA组,每组按时间分为术后6h、24h、48h、1w、2w、4w、8w7个亚组。采用6-OHDA左侧纹状体两点注射法建立PD大鼠模型,假手术组注射0.02%抗坏血酸溶液。术后不同时间点观察阿扑吗啡(R-(-)-Apomorphinehydrochloridehemihydrate,APO)诱发大鼠旋转行为学的变化,ELISA法测定各时间点大鼠左侧纹状体区DA和Ach含量,HE染色观察左侧中脑黑质区多巴胺能神经元病理形态学的改变。实验二：实验一动物取材时留取左侧中脑组织,westernblot法检测术后各个时间点Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的动态表达。实验三：造模方法同实验一,雄性SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、6-OHDA造模组,将造模成功的PD大鼠随机分为模型组、帕病2号方低剂量组(8.0g生药/Kg)、帕病2号方中剂量组(16.0g生药/Kg)、帕病2号方高剂量组(32.0g生药/Kg)。连续4周灌胃给药。观察APO诱发的行为学变化,ELISA法测定左侧纹状体区DA和Ach含量。FRAP法检测左侧纹状体组织T-AOC含量。Westernblot法检测左侧中脑组织Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的表达。RT-PCR法检测左侧中脑组织Nrf2、HO-1mRNA表达。实验四：造模方法同实验一,雄性SD大鼠随机分为正常对照组,假手术组,模型组,帕病2号方治疗组(32.0g生药/Kg)。连续4周灌胃给药,比较治疗后各组大鼠体重变化,网格实验观察大鼠移动潜伏期,尼氏染色观察左侧中脑多巴胺能神经元的形态,免疫组织化学技术检测左侧中脑组织TH、Nrf2、HO-1蛋白的表达分布。结果：实验一：1.行为学方面：假手术组各时间点经APO诱发均未出现异常旋转行为。6-OHDA造模成功大鼠经APO诱导出现典型的右侧旋转行为,24h与6h大鼠右侧旋转速度比较无明显差异(P>0.05),48h、1w、2w、4w大鼠右侧旋转速度逐渐增快,分别与相应前一时间点比较,差异有统计学意义(P<0.05),4w大鼠右侧旋转速度达到高峰,4w与8w大鼠恒定右侧旋转速度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.DA和Ach含量变化：假手术组各时间点DA和Ach无显著差异(P均>0.05)。6-OHDA术后6hDA含量降低,与假手术6h比较,差异有统计学意义(P<0.05),6-OHDA术后1w、2w、4wDA含量明显减少,分别与相应前一时间点比较,差异均有统计学意义(P均<0.05),6-OHDA术后4w与8wDA含量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较,6-OHDA术后6h、24hAch无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。6-OHDA术后48h、1w、2w、4wAch含量明显升高,分别与相应前一时间点比较,差异有统计学意义(P均<0.05),6-OHDA术后4w与8wAch含量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.HE染色：光镜下观察,假手术组各时间点左侧黑质区组织结构清晰,神经元形态完整,排列整齐,数量多,细胞核清晰,核仁明显,神经纤维排列整齐,结构紧密。6-OHDA造模组6h部分神经元形态正常,可见少量神经元肿胀,细胞边缘突出,胞核稍大。24h、48h、1w可见大量神经元胞体肿胀,细胞核变大,核呈空泡状,部分出现核裂解,胶质细胞增多。1w可见部分神经元周围出现4-6个胶质细胞围绕,形成卫星现象。2w时神经元肿胀减轻,核仁明显偏移或破裂。随着造模时间的延长,神经元数量减少,4w、8w神经元凝固性坏死,核仁不明显,伴有大量胶质细胞弥漫性或局限性增生,可见小胶质细胞进入坏死神经元的胞体或突起中,形成噬神经细胞现象。实验二：假手术组术后各时间点Nrf2核蛋白、HO-1蛋白低表达,不同时间点相比差异无统计学意义(P>0.05)。6-OHDA组术后各时间点相比,6hNrf2核蛋白表达升高,24hHO-1蛋白表达升高,1w达高峰,2w、4w、8w有所回落,与假手术组相应时间点比较仍表达较高(P<0.01)。实验三：1.行为学变化：正常组、假手术组大鼠活动正常,无异常旋转行为。模型组、帕病2号方低剂量组治疗前后大鼠右侧旋转速度比较,差异无统计学意义(P>0.05)；帕病2号方中、高剂量组治疗前后大鼠右侧旋转速度比较,差异均有统计学意义(P<0.05)；与帕病2号方中剂量组比较,帕病2号方高剂量组大鼠右侧旋转速度明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)2.正常组与假手术组左侧中脑组织Nrf2核蛋白、H0-1蛋白呈低表达,两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)；与正常组大鼠比较,模型组、帕病2号方各治疗组Nrf2核蛋白、HO-1蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组大鼠比较,帕病2号方各治疗组Nrf2核蛋白、HO-1蛋白表达均明显升高,差异有统计学意义(均P<0.01)；与帕病2号方低剂量组比较,帕病2号方中剂量组Nrf2核蛋白、HO-1蛋白表达无明显升高,差异无统计学意义(P>0.05),与帕病2号方中剂量组比较,帕病2号方高剂量组Nrf2核蛋白、HO-1蛋白表达显著上调,差异有统计学意义(P<0.01)。3.DA和Ach含量：与正常组比较,假手术组左侧纹状体DA、Ach含量无明显变化,差异无统计学意义(均P>0.05),模型组左侧纹状体DA含量明显减少(P<0.05),Ach含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较,帕病2号方低剂量组DA含量升高不明显(P>0.05),中、高剂量组DA含量明显升高(P<0.05或P<0.01)；与低剂量比较,高剂量组DA含量明显升高(P<0.05)。与模型组比较,低、中、高剂量组Ach含量均下降(均P<0.05)；与低、中剂量组比较,高剂量组Ach含量下降明显,差异有统计学意义(P<0.05)。4.总抗氧化能力(T-AOC):与正常组比较,假手术组左侧纹状体T-AOC含量无明显变化(P>0.05),模型组、帕病2号方各治疗组左侧纹状体T-AOC含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较,帕病2号方各治疗组能够明显提高PD模型鼠左侧纹状体T-AOC含量(P<0.05),且高剂量组作用明显。实验四：1.体重：造模前各组体重两两比较,差异无统计学意义(P>0.05),治疗后,正常组与假手术组体重比较,差异无统计学意义(P>0.05),与正常组比较,模型组和帕病2号方治疗组体重偏轻,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),与模型组比较,帕病2号方治疗组体重增加,差异有统计学意义(P<0.01)。2.网格实验：与正常组比较,假手术组移动潜伏期无显著变化(P>0.05)；与正常组比较,模型组与帕病2号方治疗组大鼠移动潜伏期显著延长,差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较,帕病2号方治疗组大鼠运动能力有所提高,移动潜伏期时间缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。3.尼氏染色：正常组、假手术组大鼠黑质致密带神经元结构形态正常,为大中型锥体细胞,细胞核淡染,核仁明显,细胞质呈蓝色,尼氏小体呈均一紫蓝色着色分布于细胞核周围,清晰可见。模型组大鼠黑质致密带神经元数目明显减少,细胞核固缩或偏移,部分核仁可见,细胞质中央尼氏小体溶解消失,胞质呈苍白均质状,完整神经元数目明显减少。帕病2号方治疗组,完整神经元数目较模型组明显增多,尼氏体染色数量相对增多。4.TH免疫组化染色：正常组,假手术TH免疫反应阳性细胞呈棕褐色,密集分布,数量多,神经元突起明显。模型组神经元数目减少,神经元突起不清晰。正常组与假手术组左侧黑质区TH阳性细胞数目比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、帕病2号方治疗组左侧黑质区TH免疫反应阳性细胞数目较正常组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。帕病2号方治疗组左侧黑质区TH阳性细胞数目较模型组增多,差异有统计学意义(P<0.05)。5.Nrf2、HO-1免疫组化染色：正常组、假手术组各大鼠左侧中脑黑质区可见Nrf2细胞浆阳性表达,无明显细胞核阳性表达,模型组各大鼠左侧中脑黑质区Nrf2细胞浆和细胞核均有表达,帕病2号方治疗组Nrf2细胞浆和细胞核内均表达,且以细胞核内表达明显。各组间Nrf2阳性表达IOD值比较：正常组与假手术组两组IOD值比较,差异无统计学意义(P>0.05),模型组胞浆内表达降低,IOD值下降,细胞核内表达增加,IOD值升高,与正常组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01),帕病2号方治疗组,胞浆内表达明显降低,IOD值降低,细胞核内表达增加,IOD值升高,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。正常组,假手术组黑质神经元HO-1蛋白无明显阳性表达,模型组可见少许阳性表达,帕病2号方治疗组可见明显的阳性表达,各组间阳性细胞IOD值表达比较：正常组与假手术组大鼠左侧中脑黑质区HO-1蛋白IOD值较低,差异无统计学意义(P>0.05),模型组HO-1蛋白IOD值升高,与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.01),帕病2号方治疗组HO-1蛋白IOD值明显降低,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论：1.6-OHDA造模后,随着造模时间延长,大鼠左侧纹状体内DA含量逐渐下降,Ach含量逐渐上升,于术后4w达到稳定状态,与大鼠右侧旋转行为表现一致。2.6-OHDA造模后可以激活Nrf2蛋白,帕病2号方干预后进一步提高Nrf2核蛋白和Nrf2mRNA表达,进而上调下游靶基因HO-1蛋白及HO-1mRNA的表达,且帕病2号方高剂量组作用更为明显。3.帕病2号方灌胃干预PD大鼠,通过调节纹状体区DA,Ach含量,提高中脑黑质区Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的表达,抑制6-OHDA对多巴胺能神经元的氧化应激损伤,提高机体抗氧化能力,从而发挥神经元保护作用。
【作者】赵贝贝；
【导师】雒晓东；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医内科学，2014，博士
【关键词】帕金森病；帕病2号方；多巴胺能神经元；多巴胺；乙酰胆碱；Nrf2；HO-1；氧化应激；

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