游离脂肪酸受体GPR40对胰腺β细胞胰岛素合成分泌的调控及配体不依赖受体内吞机制的研究
【摘要】游离脂肪酸作为人体重要的营养物质,同时又是重要的信使物质,通过G蛋白偶联受体(GPCRs)起调节代谢等生理作用。最近研究表明,长链脂肪酸亚油酸是胰岛p细胞高表达的GPR40受体的内源性配体,可以通过GPR40呈葡萄糖依赖性的促进胰岛素合成和分泌。此外GPR40还能辅助DPP-IV抑制剂促进胰岛素的分泌。本文为了解析GPR40增强胰岛素分泌的机制,采用cAMP响应元件(CRE)荧光素酶报告系统检测到在细胞水平上游离脂肪酸和forskolin共孵育会显著提高荧光素酶活性,其小分子激动剂GW9508也有同样效果,并能被特异拮抗剂GW1100抑制。此外,PDE的普遍抑制剂IBMX和两种异构体抑制剂MMPX,Rolipram证实了PDE1能协助亚油酸介导的荧光素酶活性提高,而非PDE4。进一步的Gs小肽拮抗实验证实亚油酸和forskolin协同介导的荧光素酶活性的提高并不通过Gs蛋白,而Gq的特异性抑制剂UBO-QIC能显著地抑制这种GPR40介导的CREB活性增强。PKC抑制剂和cAMPELISA检测验证了Gq/PKC/CREB通路而非cAMP的激活来协助cAMP/PKA通路发挥增效作用,并且PKC通过磷酸化CREB的Ser133,121位点来激活转录,8-CPT-cAMP也证实了cAMP是该通路中重要的一环。用艾塞那肽取代forskolin发现,亚油酸同样有协同艾塞那肽增强荧光素强度的作用,并且通过Gq/PKC/CREB信号通路来协同GLP-1R/Gs/PKA通路。将细胞水平的实验在SD大鼠上重复后,发现亚油酸同样协同forskolin或exentin-4来促进胰岛素的分泌,相比于单独作用得到显著提高。用PKC抑制剂Go6983和Gq抑制剂UBO-QIC处理后能显著抑制胰岛素的分泌,在敲除Gq亚基的小鼠上也同样抑制了亚油酸和forskolin或exendin-4激起的胰岛素分泌。因此亚油酸能协同forskolin和exentin-4促进胰岛素的分泌,随后我们发现利拉鲁肽侧链带有棕榈酸修饰,而棕榈酸是GPR40的内源性配体,利拉鲁肽和艾塞那肽对于激活GLP-1R具有相同的活性,将侧链用做亚油酸修饰发现能激活GPR40,并也能激活GLP-1R。在同时转染GPR40和GLP-1R的细胞株中,利拉鲁肽活性提高了20%。我们的研究为有效地治疗糖尿病提供了新的思路。在稳定表达GPR40-EGFP的HEK293细胞中,GPR40具有配体依赖型内吞和配体不依赖型内吞两种方式。不仅在HEK293细胞中,在β-TC-6,GPR40内源性细胞中过表达GPR40也发现有配体不依赖型内吞的存在。用FITC-anti-Flag抗体标记GPR40受体的实验表明在荧光显微镜下观察到的GPR40大量聚集在胞质内不是由于受体高表达所致,而是由于配体不依赖型内吞造成的。Arrestin-3和GRK2敲除实验发现配体依赖型内吞依赖于GRK2和arrestin-3,而配体不依赖内吞则不依赖GRKs和arrestins。此外,GPR40配体依赖型内吞能与Rab4/Rab5共定位,而配体不依赖型内吞及再循环则不经过Rab4通路,而能同Rab5共定位。由于脂肪酸家族具有高度同源性,因此该发现能运用到其他脂肪酸家族成员。并且受体经历不同的内吞途径,如果能找到与配体不依赖型内吞相关的结合蛋白,则可以用来筛选阻断自激活内吞行为的化合物。
【作者】钱晶；
【导师】周耐明；
【作者基本信息】浙江大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】胰岛素；蛋白激酶C；磷酸二酯酶；Arrestin蛋白；G蛋白调节激酶GRK；小G蛋白Rab；
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