MCPIP1对SMC表型的调节及其与动脉粥样硬化的相关性研究

【摘要】第一章：MCPIP1在动脉粥样硬化小鼠主动脉的表达及细胞定位目的：单核细胞趋化蛋白-1诱导蛋白是新近发现的一类CCCH型锌指家族分子。大量研究表明其在炎症反应、免疫稳态、细胞分化、自噬和凋亡等诸多方面发挥重要的调节作用。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,但目前对MCPIP1与动脉粥样硬化之间的关系尚不十分了解。因此本研究的主要目的是观察MCPIP1在动脉粥样硬化小鼠主动脉的表达水平及细胞定位。方法：采用高胆固醇饮食喂养8周龄apoE-/-小鼠,建立小鼠动脉粥样硬化模型。分别进行以下实验：(1)检测小鼠血清血脂水平；(2)通过大体观、苏丹Ⅲ和HE染色,观察小鼠主动脉斑块形成情况；(3)通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清MCP1水平；(4)采用WesternBlot检测小鼠胸主动脉MCPIP1蛋白表达；(5)通过激光共聚焦显微镜观察MCPIP1在小鼠胸主动脉的细胞定位。结果：血清血脂水平检测发现,与C57BL/6小鼠相比,高脂喂养apoE-/-小鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平明显较高(P<0.05),而高密度脂蛋白(HDL-C)水平明显较低(P<0.05)。通过大体观、苏丹Ⅲ和HE染色发现,与C57BL/6小鼠相比,高脂喂养apoE-/-小鼠主动脉粥样斑块面积明显较大,有显著性差异(P<0.05)；酶联免疫吸附法(ELISA)检测发现,与C57BL/6小鼠相比,高脂喂养apoE-/-小鼠血清MCP1水平明显较高,有显著性差异(P<0.05);WesternBlot检测发现,与C57BL/6小鼠相比,高脂喂养apoE-/-小鼠胸主动脉MCPIP1蛋白表达显著下调,有显著性差异(P<0.05)；免疫荧光检测发现小鼠主动脉血管平滑肌细胞和内皮细胞均有MCPIP1表达,但是其在血管平滑肌细胞中表达更为显著。结论：C57BL/6小鼠和动脉粥样硬化小鼠胸主动脉均表达MCPIP1蛋白,但动脉粥样硬化小鼠胸主动脉MCPIP1的蛋白表达较同龄野生小鼠显著下降。小鼠主动脉血管平滑肌细胞和内皮细胞均有MCPIP1表达,但是其主要定位于动脉壁的平滑肌细胞中。第二章：MCPIP1血管平滑肌细胞表型标志物表达的影响及机制探讨目的：我们前期在体研究已证实动脉粥样硬化小鼠胸主动MCPIP1蛋白表达较同龄野生小鼠显著下降,且小鼠主动脉的MCPIP1主要定位于血管平滑肌细胞。目前认为体外培养的VSMC主要表现为分化程度较低的合成型VSMC,我们初步研究发现其仅表达极少量的MCPIP1蛋白。已知血管平滑肌细胞表型转化与动脉粥样硬化密切相关,由此,我们推测MCPIP1可能通过调节VSMC表型,影响动脉粥样硬化的发生与发展。因此本研究的主要目的为体外观察MCPIP1对血管平滑肌细胞表型标志物表达的影响,并进一步探讨其可能机制。方法：利用免疫荧光对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞进行鉴定。用不同浓度的MCP1(0、50、100ng/ml)干预人和大鼠平滑肌细胞24小时后,用WesternBlot和RealtimeqPCR分别检测细胞内MCPIP1、myocardin及其下游靶基因SM-a-actin、SM22蛋白及mRNA的表达水平。用携带MCPIP1的重组腺病毒转染hSMCs48h,检测细胞内MCPIP1、myocardin及其下游靶分子SM-a-actin、SM22的蛋白表达水平。结果：使用不同浓度MCP1刺激人和大鼠血管平滑肌细胞发现,与对照组(0ng/mlMCP1)相比,100ng/mlMCP1处理显著诱导人和大鼠血管平滑肌细胞MCPIP1的mRNA和蛋白表达上调。与对照组1(0ng/mlMCP1)相比,100ng/mlMCP1处理显著诱导人和大鼠血管平滑肌细胞SM-a-actin、SM22、myocardin的mRNA和蛋白表达上调。采用携带MCPIP1的重组腺病毒转染hSMCs48h发现,与空白对照组和Ad-GFP(空载病毒载体)组相比,Ad-MCPIP1组MCPIP1蛋白表达显著上调。此外,Ad-MCPIP1组SM-a-actin、SM22和myocardin蛋白的表达也显著上调。结论：MCPIP1可促进VSMC收缩表型标志物SM-a-actin、SM22的表达上调。此外,MCPIP1可诱导myocardin表达上调,后者可能参与介导MCPIP1对VSMC表型的调节。第三章：MCP1对组织培养大鼠胸主动脉收缩功能的影响及相关机制探讨目的：我们前期体外细胞研究发现,经MCP1处理的血管平滑肌细胞MCPIP1表达明显上调,并伴有VSMC收缩表型标志物SM-a-actin、SM22的表达上调,提示MCPIP1可参与VSMC表型分化的调节。因此,本研究拟进一步通过离体组织培养,观察MCP1处理对组织培养血管收缩功能的影响,并初步探讨MCPIP1是否参与组织培养时血管平滑肌细胞去分化过程。方法：获取大鼠胸主动脉,等分为长约2mm血管环,分为三组：(1)新鲜血管组；(2)无血清DMEM培养基中孵育72h；(3)含MCP1(100ng/ml)的无血清DMEM培养基中孵育72h。然后将样本用于以下实验：(1)用myograph技术检测血管环对KC1和PE的收缩反应；(2)用WesternBlot检测血管环MCPIP1、myocardin及其下游靶分子SM-α-actin、SM22蛋白的表达；(3)用realtimeqPCR检测血管环MCPIP1、myocardin及其下游靶基因SM-α-actin、SM22mRNA的表达。结果：Myograph技术检测发现,与新鲜血管环相比,组织培养72小时的血管环对KC1和PE的收缩反应显著下降,而MCP1处理可部分逆转组织培养诱导的血管收缩功能下降。WesternBlot和realtimeqPCR检测发现与新鲜血管环相比,组织培养72小时的血管环MCPIP1蛋白和mRNA的表达均显著下调；而MCP1处理可部分逆转组织培养诱导的MCPIP1蛋白和mRNA的表达下调。与新鲜血管环相比,组织培养72小时的血管环SM-α-actin、SM22、myocardin蛋白和mRNA的表达均显著下调；而MCP1处理亦可部分逆转组织培养诱导的SM-α-actin、SM22、myocardin蛋白和mRNA的表达下调。结论：组织培养可导致血管收缩性下降,并伴随MCPIP1、myocardin及其下游靶分子SM-α-actin、SM22的表达下调。MCP1可部分拮抗组织培养诱导的血管收缩性下降,以及MCPIP1、myocardin及其下游靶分子SM-α-actin、SM22的表达下调。
【作者】杨阳；
【导师】彭道泉；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】单核细胞趋化蛋白诱导蛋白；动脉粥样硬化；血管平滑肌细胞；表型调节；

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