酪氨酸磷酸化蛋白和胞质动力蛋白在对虾白斑症病毒（WSSV）感染过程中的作用研究

【摘要】为研究蛋白酪氨酸磷酸化在WSSV感染过程中所发挥的作用，本论文综合运用磷酸化特异性流式细胞术、激光共聚焦显微技术和蛋白免疫印迹法（westernblotting）检测了WSSV感染后中国对虾血细胞中蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtandemmassspectrometry:MALDI-TOF-MS/MS）鉴定了血细胞内在WSSV感染过程中发生酪氨酸磷酸化的蛋白质。以期为WSSV和宿主细胞相互作用过程的研究提供理论基础。研究表明，胞质动力蛋白在很多病毒的感染过程中发挥转运病毒的功能。为研究其在WSSV感染过程中的作用，本论文首次克隆得到了胞质动力蛋白中间链基因，综合运用实时荧光定量PCR检测技术、激光共聚焦显微技术和RNA干扰技术研究了胞质动力蛋白在WSSV感染过程中基因表达量的变化及其在WSSV转运过程中的作用。本研究为探索WSSV在宿主细胞内的转运过程提供了研究线索和理论基础。具体研究内容包括以下几个部分：（1）利用磷酸化特异性流式细胞术检测了WSSV感染后中国对虾血细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化。结果显示，WSSV感染后，中国对虾血细胞分为两群：R2和R3，其中R2群血细胞表现出蛋白酪氨酸磷酸化水平的下降，而R3群血细胞则表现出蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高。随着WSSV感染进程的持续，总体血细胞的平均蛋白酪氨酸磷酸化水平表现出显著的动态变化并呈现出上调趋势，分别在WSSV感染后1和12h出现两个峰值。（2）通过激光共聚焦显微镜观察到的WSSV感染后中国对虾血细胞内蛋白酪氨酸磷酸化信号强度变化和westernblotting检测到的中国对虾血细胞内蛋白酪氨酸磷酸化蛋白条带粗细的变化与流式检测的中国对虾血细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化趋势基本一致。激光共聚焦显微观察结果显示酪氨酸磷酸化蛋白既存在于血细胞质中也存在于细胞核中，但是WSSV感染后细胞核中酪氨酸磷酸化水平的变化较细胞质显著。Westernblotting共检测到五个酪氨酸磷酸化蛋白，经质谱鉴定为α2-巨球蛋白（Alpha-2-macroglobulin:A2M）、热应激蛋白70（Heatshockprotein70:HSP70）、组蛋白H3（HistoneH3）、组蛋白H2A（HistoneH2A）和组蛋白H4（HistoneH4），其中HSP70、组蛋白H3和组蛋白H4只在WSSV感染后才发生酪氨酸磷酸化；利用实时荧光定量技术检测了中国对虾血细胞内组蛋白H2A、H3和H4基因表达量在WSSV感染后的变化，三者在病毒感染后均显著性上调表达。（3）首次利用RACE技术从甲壳纲动物——中国对虾血细胞克隆得到了胞质动力蛋白中间链（FcDYNCI）基因全序列，为研究胞质动力蛋白在WSSV转运过程中的作用奠定了基础。结果显示，FcDYNCIcDNA序列全长2582bp，含有一个1983bp的开放阅读框，该开放阅读框可以编码一个含有660个氨基酸的多肽，其理论分子量和理论等电点分别为73.4kDa和5.16。通过与昆虫纲的四种DYNCI蛋白的多序列比对分析，结果表明FcDYNCI属于胞质动力蛋白Ⅱ型中间链蛋白。（4）利用实时荧光定量技术检测了FcDYNCI基因在健康中国对虾体内各组织中的表达差异，结果显示，FcDYNCI基因在血细胞中的表达量远高于其他组织；WSSV感染后，中国对虾血细胞内FcDYNCI基因表现出显著性上调表达，约为未感染WSSV中国对虾血细胞内FcDYNCI基因表达量的3倍；WSSV感染12h后，对虾血细胞内的胞质动力蛋白能够与WSSV共定位。（5）利用RNAi技术对中国对虾体内FcDYNCI基因进行了沉默，经过两次FcDYNCIdsRNA注射后，血细胞内FcDYNCI基因表达量和蛋白量都出现显著性下调；在沉默FcDYNCI基因后，血细胞内WSSV三种基因ie1、wsv477和vp28在24h均表现出最大程度的下调表达，分别约为对照组的1/2700、1/3000和1/150。（6）利用STRING软件预测了FcDYNCI的相互作用蛋白，结果显示除胞质动力蛋白的其他组成链外，Rab7与FcDYNCI发生相互作用的概率达到80%。我们试图利用兔抗Rab7多抗，通过免疫共沉淀实验验证两者之间的相互作用关系。结果显示，在沉淀物中确实存在一条分子量大约为74kDa的蛋白条带。但是，将此条带进行质谱鉴定后，结果显示这个蛋白不能与FcDYNCI蛋白的氨基酸序列匹配。
【作者】冯继兴；
【导师】战文斌；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产养殖，2014，博士
【关键词】酪氨酸磷酸化蛋白；胞质动力蛋白；对虾白斑症病毒；中国对虾；RNA干扰；

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