刺参（Apostichopus japonicus）发酵饲料的制作工艺与应用效果研究

【摘要】本文在酿酒酵母（Saccharomgcescerevisae）、产朊假丝酵母（Candidautilis）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）和白地霉（Geotrichumcandidum）对刺参（Apostichopusjaponicus）安全性实验的基础上，以这四种菌株为发酵菌，通过对刺参饲料发酵效果的对比研究，发现酿酒酵母为发酵的最佳菌种。进一步探讨了酿酒酵母发酵刺参饲料的工艺参数，并分别研究了饲料前处理（消毒灭菌）对发酵的影响和发酵过程中大分子蛋白的降解过程。进行了发酵饲料以及投喂频率对刺参生长、能量代谢和免疫影响的研究。将饲料发酵工艺应用到稚参的规模化养殖中，研究发酵饲料对稚参生长的影响。本文主要的研究内容和实验结果如下：1.以初始体重为（4.66±0.50）g的刺参为养殖对象，进行为期21d的发酵候选菌株的安全性实验。将酿酒酵母、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和白地霉四种发酵微生物分别配制成104cfu/ml、106cfu/ml、108cfu/ml的高浓度菌悬液，将健康刺参浸浴其中，以不添加任何菌悬液的为空白对照组，观察刺参的各种不良反应。通过对实验过程中各组刺参的排脏率、肿嘴率和死亡率的比较发现，只有枯草芽孢杆菌的104cfu/ml组和产朊假丝酵母的108cfu/ml组对刺参排脏率的影响显著高于对照组（P<0.05），其余组与对照组的差异不显著（P>0.05）；对刺参肿嘴率的影响，除枯草芽孢杆菌的106cfu/ml组和其余三种菌株的108cfu/ml组均显著高于对照组外（P<0.05），其余组与对照组的差异均不显著（P>0.05）；除枯草芽孢杆菌和白地霉的106cfu/ml组、四种菌株的108cfu/ml组中刺参的死亡率显著高于对照组（P<0.05）外，其余组与对照组差异均不显著（P>0.05）。并且通过计算得出，发酵饲料投喂后其中的发酵菌在养殖水体中最高浓度为104cfu/ml。并且，在本实验的管理条件下四株候选菌浓度为104cfu/ml时对刺参是安全的。因此，在此浓度范围内四种菌株均可用来发酵刺参饲料。2.为寻找发酵刺参饲料最佳的微生物菌株，本实验对酿酒酵母、产朊徦丝酵母、枯草芽孢杆菌和白地霉四种菌株分别发酵刺参饲料进行相关研究。在接种量为10%（V/W），含水量70%，温度为25℃的条件下进行为期5d的发酵实验。实验分为五组，分别是酿酒酵母组、产朊假丝酵母组、枯草芽孢杆菌组、白地霉组和空白对照组，每组接种对应的发酵微生物，空白对照组加入等量的生理盐水。实验期间每天对饲料的感官指标和理化指标进行测定、记录，理化指标主要包括干物质回收率（DMR）、粗蛋白（CP）、氨基酸态的氮在总氮中所占的百分比（AA-N/tN）、氨态氮在总氮中所占的百分比（NH3-N/tN）、发酵菌在微生物总量中所占的比例和弧菌在微生物总量中所占的比例，感官指标主要包括颜色、气味和黏度。结果显示，在发酵的第3d酿酒酵母组的DMR、CP、AA-N/tN均达到最高水平，发酵菌所占比例仅次于产朊假丝酵母组，NH3-N/tN和弧菌所占比例也在理想的范围内。同时，气味、颜色等感官指标的综合评分达到最高值。因此，在本研究中酿酒酵母是刺参饲料发酵的最适宜的菌株。3.本研究采用上述筛选的最适菌株酿酒酵母为发酵菌种，分别在饲料含水量（以干物质计）为50%、60%、70%、80%，温度为20℃、25℃、30℃、35℃，时间为1d、2d、3d、4d、5d的条件下，开展刺参饲料发酵条件优化的研究。按照10%（V/W）的接种量接入酿酒酵母种子液，分别对不同含水量、不同温度和不同发酵时间条件下发酵饲料的理化指标和感官性状评价指标进行测定。结果表明，发酵温度为25℃，含水量70%的实验组在发酵时间为3d时，理化指标中的干物质回收率、粗蛋白含量和氨基酸态氮占总氮的含量分别达到最高值，氨态氮占总氮的含量也在理想范围之内。此时，发酵饲料的气味、颜色等综合感观性状指标达到最佳水平。因此，在本实验条件下酿酒酵母可以作为发酵刺参饲料的备选菌种，其最佳发酵条件为：环境温度25℃、基础饲料含水量70%、发酵时间3d。上述优化的发酵饲料工艺参数将为刺参新型饲料的制备提供技术参考。4.本实验采用上述优化的最佳发酵工艺进行刺参饲料的发酵，每12h取一次样，6个样品经过Tris-HCl缓冲液浸提、离心后得到电泳样品。在分离胶浓度为15%、浓缩胶浓度为5%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中进行大分子蛋白降解过程的研究。采用考马斯亮蓝R-250对凝胶进行染色，再经冰醋酸脱色液处理后，观察凝胶中的蛋白条带的变化。结果显示，随着发酵的进行，大分子条带逐渐消失；而小分子条带有所增加。说明部分大分子蛋白被降解成多肽、肽等小分子的物质。5.本实验采用65℃湿热灭菌30min的方式对饲料发酵前进行消毒灭菌处理，再按照上述的最佳发酵工艺分别对经过消毒灭菌处理和未经消毒灭菌处理的饲料进行发酵。以不添加酿酒酵母的经前处理和未经前处理的饲料分别作为空白对照组。各组饲料发酵结束后，分别取样检测包括发酵菌和弧菌分别在微生物总量中所占比例、干物质回收率、粗蛋白含量的理化指标和包括颜色、气味、黏度的感官评价指标。结果显示，添加酿酒酵母的两个饲料组的发酵菌所占比例、弧菌所占比例、干物质回收率以及粗蛋白含量均无显著性的差异（P>0.05），但分别显著高于未添加酿酒酵母的饲料组（P<0.05）；此时，在颜色、气味和黏度方面添加发酵菌的两个饲料组之间均无显著差异（P>0.05）。可见，在本实验的半密闭发酵条件下，对饲料原料进行消毒灭菌的前处理后再进行发酵的效果不明显。6.本实验采用发酵饲料和未发酵饲料分别投喂A（4g左右）、B（8g左右）、C（20g左右）三种大小不同的刺参，研究两种饲料对三种规格刺参生长、能量分配和免疫的影响。经过50d的投喂实验，结果表明，在规格A中，投喂发酵饲料刺参的特定生长率、饲料效率及实验结束时的脏壁比均比未发酵饲料的高，摄食率、排粪率则均小于未发酵饲料的。其中，两种饲料的饲料效率差异显著（P<0.05）。规格B中投喂发酵饲料与未发酵饲料刺参的各生长指标变化情况与规格A的一致，除摄食率、排粪率外，其余生长指标两饲料组的差异均显著（P<0.05）。在规格C中刺参投喂发酵饲料的排粪率高于未发酵饲料的，除此之外，投喂两种饲料的其余各生长指标变化情况与规格B刺参的一致。同时，从刺参大小来看，发酵饲料更有利于较小规格刺参的生长。在能量分配方面，投喂发酵饲料的三种规格刺参用于生长的能量在摄食能中所占比例均高于未发酵饲料的；同时，投喂发酵饲料的的刺参随着规格的增大用于生长的能量逐渐减少。并且，发酵饲料能提高刺参的超氧化物歧化酶、溶菌酶等非特异性免疫酶的活性。因此，从促进刺参生长和节约饲料的角度考虑，在三种规格刺参的养殖中发酵饲料优于未发酵饲料。7.本实验采用发酵饲料投喂大小为（11.18±0.46）g的刺参，研究1次/2d、1次/d、2次/d三种不同投喂频率对刺参生长、能量分配及免疫的影响。经过50d的养殖实验，结果表明，当投喂频率为1次/d时，刺参的特定生长率和饲料效率最高，均显著高于其他两种投喂频率的（P<0.05）；刺参对发酵饲料的表观消化率随投喂频率的增加而逐渐下降，排粪率则呈现逐渐上升的趋势；投喂频率对刺参的摄食率没有显著的影响（P>0.05）；刺参的脏壁比在投喂频率为1次/d时最高，并且显著高于2次/d的（P<0.05）。投喂频率为1次/d时，刺参的生长能、生长能在摄食能中所占比例分别显著高于其余投喂频率的（P<0.05）。投喂频率在一定程度上能提高刺参的酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶等非特异性免疫酶的活性。因此，在本实验条件下最佳投喂频率为1次/d。在最佳投喂频率下对刺参进行养殖，既能有效促进刺参的生长，又可以提高饲料的转化效率。8.本实验采用前面优化的刺参发酵饲料的工艺对稚参饲料进行发酵，通过对发酵前后饲料的粗蛋白含量进行测定发现，发酵后饲料的粗蛋白含量显著升高（P<0.05）。将发酵的饲料在7.5cm3的水泥池中对初始体重（3.15±0.05）kg/池的稚幼参进行规模化投喂实验。同时，以未发酵的稚参饲料作为对照组，每个处理组26个平行。经过35d的投喂实验，结果显示，投喂发酵饲料的幼参末体重显著高于未发酵饲料的（P<0.05），在刺参肠道的充盈度方面也是投喂发酵饲料的较好，在增重率和特定生长率方面投喂发酵饲料的刺参分别显著高于未发酵饲料的（P<0.05）。因此，在保苗中将饲料进行适当的发酵有利于刺参的健康、快速生长。
【作者】姜燕；
【导师】麦康森；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产养殖，2014，博士
【关键词】刺参；发酵菌；发酵饲料；工艺参数；生长；能量分配；

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