褐飞虱气味结合蛋白基因克隆与分析

【摘要】昆虫嗅觉在其各项行为活动中如寻找寄主、配偶或适合的产卵场所等具有极其重要的作用。如果明确昆虫的嗅觉机制,将可为害虫防治与监控提供新思路。目前研究表明,气味结合蛋白(odorant-bindingproteins,OBPs)在嗅觉感受的气味分子运输中起着重要作用,但对于其确切的生理功能尚未明确。褐飞虱Nilaparvatalugens(Stal)是一种水稻和野生稻的专食性害虫,具迁飞性,其成虫及若虫多聚集于阴暗潮湿的水稻基部取食。随着褐飞虱抗药性的增强,普通的化学防治已经难以控制褐飞虱的为害。如果能明确褐飞虱的嗅觉感受机制,将可为利用行为调控褐飞虱提供理论依据。为此,本课题以褐飞虱为研究对象,通过克隆OBPs基因,测定了OBPs基因的时空表达谱,分析了重组OBPs蛋白与水稻挥发物的结合特性,以期为明确OBPs在褐飞虱嗅觉反应中的生理功能奠定理论基础。本文的主要研究结果如下：1褐飞虱气味结合蛋白基因(NlugOBPs)的克隆及序列分析基于实验室已建转录组数据,克隆了褐飞虱NlugOBP、NlugOBP5、NlugOBP6.NlugOBP7等4个基因,分析结果表明,这些NlugOBPs都具有完整的开放阅读框,大小分别为514bp、495bp、591bp.426bp,编码167、164、196、141个氨基酸(GenBank后登录号分别为KC663683、KC663684、KC663685、KC663686)；通过对4条OBPs基因的氨基酸序列比对分析,表明它们都具有6个保守的半胱氨酸位点,并无保守位点缺失及增加的现象,表明它们都属于ClassicOBPs;经过N-末端信号肽预测显示,NlugOBP6和NlugOBP7分别包含19和20个氨基酸组成的信号肽序列,而NlugOBP4和NlugOBP5无信号肽。2褐飞虱NlugOBPs基因的时空表达谱研究通过荧光定量检测褐飞虱NlugOBP6、NlugOBP7、NlugOBP8、NlugOBP9等4个基因的时空表达谱。结果表明,4个NlugOBPs基因均主要表达于褐飞虱触角,且在触角中的表达量受到褐飞虱日龄的影响；在同一发育时期,NlugOBPs基因在雌虫中的表达量显著高于雄虫中的表达量；除了个别日龄外,NlugOBPs基因在不同翅型间的表达量并未存在明显差异；NlugOBPs基因在短翅雌虫中的相对表达量明显受交配与否的影响,3日龄未交配褐飞虱NlugOBPs基因的表达量明显大于已交配的褐飞虱(P<0.05)；5日龄已交配长翅褐飞虱NlugOBP6基因的表达量显著高于未交配褐飞虱；而在5日龄未交配短翅褐飞虱中的表达量高于已交配褐飞虱(P<0.01)。3褐飞虱NlugOBPs的原核表达、纯化及结合特性分析成功构建了NlugOBP4与原核表达载体pET-22b的重组质粒,并将重组质粒导入表达宿主细胞BL21(DE3)中成功表达；通过包涵体变复性获得含大量目的蛋白的杂蛋白液,再经DE52和QFF阴离子交换层析柱纯化,获得纯化的重组蛋白NlugOBP4。以1-NPN为荧光探针,利用荧光竞争结合试验,研究了NlugOBP4与37种水稻挥发物分别在酸性(pH=5.0)和中性(pH=7.4)环境中的结合特性。结果表明,NlugOBP4在中性条件下与气味分子的结合能力高于酸性条件下；在中性环境中,NlugOBP4与酮类、醛类、萜烯类都具有较好的结合,烷类和醇类次之,推测这些物质可以作为开发引诱剂或生物农药的主要成分。
【作者】周爽爽；
【导师】王满囷；
【作者基本信息】华中农业大学，农业昆虫与害虫防治，2014，硕士
【关键词】褐飞虱；气味结合蛋白；基因时空表达谱；原核表达；荧光竞争结合；

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