放线菌产安莎类和环醇类抗生素合成基因资源的挖掘

【摘要】放线菌是各种天然活性化合物的重要来源。传统的天然产物获得方法需要对菌株的发酵产物进行逐级分离,存在周期长、效率低且难以预知产物具体结构类型等问题,而新兴的分子生物学和生物合成技术可以用于指导从微生物中分离特定类型的活性化合物。本论文以本课题组从不同来源材料中分离到的830株放线菌为基础,应用基因挖掘的方法,从中筛选出了具有产生安莎类、氨基环醇类活性化合物潜能的菌株。根据这两类化合物特殊合成单元生物合成过程中的蛋白酶氨基酸序列设计简并引物,从不同菌株的基因组DNA中通过聚合酶链式扩增、产物测序验证的方法筛选出具有相应基因的菌株。根据16SrRNA系统发育树选择其中进化分支独特的菌株进行特异基因的转录水平检测,观察到该基因表达者再采用Southern杂交、基因组扫描分析等方法对其基因资源进行深入详细的探索研究,同时对筛选得到的菌株进行遗传操作条件和发酵培养摸索,以期从其中分离出目的类型化合物。3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)是安莎类抗生素的特殊合成起始单元,完成AHBA合成最后一步的蛋白质是AHBA合酶。我们利用已知引物AHBA-F/R2从菌种库中冻存的600株放线菌中筛选得到16株AHBA合酶基因阳性菌株。在此基础上根据包含丝裂霉素的AHBA合酶蛋白序列保守区域设计得到简并引物AHBA-A’F/CR,从这600株菌中筛选得到新的37株AHBA合酶基因阳性的菌株。此外,利用这对自行设计的引物,从新保存的230株放线菌中筛选出33株AHBA合酶基因阳性的菌株。这些阳性菌株的PCR产物测序比对后都与Genbank中已知AHBA合成酶基因同源,且具有丰富的多态性。对新保存菌株中的33株AHBA合成酶基因阳性菌株构建16SrRNA系统发育树,选择其中22株进化分支独立者进行了AHBA基因转录水平检测,结果表明A00941、A009682株菌在该条件下表达了AHBA基因。以AHBA为底物对A00941、A00968进行前体喂养实验,发酵产物的HPLC检测分析结果显示若干产物峰在喂养后出现或增高。选择基因表达水平较高的菌株A00941进行全基因组扫描测序,发现其中包含合成AHBA的全套基因及连锁的聚酮链合成相关基因簇。目前对A00941菌株的发酵条件优化及产物分离工作正在开展中。在筛选环醇类抗生素产生菌的过程中,根据2-表-5-表-有效醇酮合酶的同源蛋白序列设计得到简并引物CYC-AF/DR,从菌种库中共筛选到20株该基因阳性的放线菌,经过测序比对验证,结果表明其中5株与Genbank中已知的氨基环醇类化合物产生菌的相关合成基因具有同源性,说明这些菌株具有产生氨基环醇类化合物的潜力。以特殊保守酶为探针可以有效地挖掘未知阳性菌株及基因资源,指导新天然产物的分离,促进自然界中新抗生素的发现。
【作者】凡琴；
【导师】宋思扬；
【作者基本信息】厦门大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】基因挖掘；安莎类；氨基环醇类；基因组扫描；

【参考文献】
[1]李雨株.大跨径覆土波纹钢板桥涵结构的受力性能研究[D].北京交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[2]曹高辉.电子政务信息集成研究[D].华中师范大学,2005.
[3]曹秋良.参与努力与捐赠额度对善因营销的作用效果及影响机制研究[D].华中科技大学,企业管理,2012,硕士.
[4]任雪琴.两种植物的化学成分研究[D].武汉工业学院,微生物与生化药学,2012,硕士.
[5]刘勇,常国岑,王晓晖.网络安全管理联动系统的设计与实现[J].计算机安全,2002,10:35-37.
[6]何银杏.《新标准汉语》（初）与《速成汉语初级教程》（综合课本）的比较研究[D].湖南师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[7]张威.特殊条件下太阳能平板集热器性能研究[D].西安建筑科技大学,供热、供燃气、通风与空调工程,2013,硕士.
[8]王江超.多用户OFDM系统中的跨层资源分配设计[D].南京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[9]严子琴,黄海婵,王畅,赵雷,钟卫鸿.低分子肝素制备的研究进展[J].中国生化药物杂志,2012,06:913-916.
[10]胡茂杰,潘丙才,毛亮.石墨烯及其衍生物在小鼠体内的分布与毒性效应[J].南京大学学报(自然科学),2014,04:431-439.
[11]杨静.基于数理分析的湖南省高新技术产业技术创新能力评价[D].湖南师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[12]徐洪浩.不同管径两级溴化锂溶液气泡泵运行特性实验研究[D].大连海事大学,轮机工程,2013,硕士.
[13]彭可.网络环境下的公民政治认同研究[D].上海交通大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[14]崔宪.凹山选厂入选高村与凹山混合矿石的工艺适应性研究[J].金属矿山.2001(07)
[15]王保丽,印兴耀,张繁昌.基于Gray近似的弹性波阻抗方程及反演[J].石油地球物理勘探,2007,04:435-439+488+359.
[16]刘明星.供电企业营销效果指标评价[D].华北电力大学（北京）,技术经济及管理,2003,硕士.
[17]罗敏.北京巴士传媒股份有限公司发展战略研究[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[18]张健.基于企业架构理论的中国建设银行核心业务系统优化研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[19]陈增强,车海平,袁著祉,崔保民.预测－PID　串级控制及其在锅炉液位系统中的应用[J].控制与决策,1994,05:379-382.
[20]王春先.纳米材料的制备、表征及特效试剂的合成[D].山东师范大学,分析化学,2003,硕士.
[21]陆阳.商标指示性合理使用制度研究[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[22]黎静.大豆源蛋白饲料原料中三聚氰胺/三聚氰酸的近红外显微成像分析方法研究[D].中国农业大学,2014.
[23]徐速.龙门山中段基性一超基性岩类地质特征及成因探讨[D].成都理工大学,矿物学、岩石学、矿床学,2013,硕士.
[24]王任其.基于UML的企业科技信息管理系统的分析与设计[D].浙江工业大学,2013.
[25]于宏丽.旋转机械故障数据库与故障精密诊断系统开发[D].华北电力大学（北京）,机械电子工程,2004,硕士.
[26]李家栋,王昭东,李勇,付天亮,王国栋,路江海.连续固溶热处理线自动控制系统的开发及应用[J].冶金自动化,2010,04:32-36.
[27]王磊.新形势下中铁X局集团发展战略研究[D].西南交通大学,工商管理,2012,硕士.
[28]赵承勇.山西省高职院校健美操运动开展现状及对策研究[D].河北师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[29]李春华,黄伟雄,袁志昌,张永康,姜齐荣,王亮.南方电网±200Mvar链式STATCOM系统控制策略[J].电力系统自动化,2013,03:116-121.
[30]李宏毅,施正荣.太阳能光伏发电技术(17)[J].建筑创作.2005(07)
[31]严峰萍.论罗纳德·贝耶笔下亚特兰大的种族空间政治[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[32]陈雪.网络化串级控制系统的模型预测控制[D].东北大学,控制理论与控制工程,2010,硕士.
[33]宋大为,黄泽仁.转炉付枪测温定碳变换器[J].冶金自动化,1978,02:26-33.
[34]许婷.重庆市城乡基本公共服务供给均等化程度与策略优化研究[D].重庆大学,行政管理,2014,硕士.
[35]伍文振.刑事再审制度研究[D].广西师范大学,法学,2013,硕士.
[36]朱巍志.双铰坦拱桥的模型试验研究与分析[D].大连理工大学,桥梁与隧道工程,2004,硕士.
[37]柴轶男.寿光市农业推广服务体系模式创新研究[D].西北农林科技大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[38]黄越.复制缺陷型腺病毒Ad-pShuttle-CMV-p14ARF联合半夏凝集素对结肠癌细胞生长抑制的研究[D].浙江理工大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[39]刘富.基于低碳思路的山西产业结构优化分析[D].山西财经大学,产业经济学,2014,硕士.
[40]杜豫川,孙立军.高速公路全寿命管理系统研究[J].中国公路学报,2001,S1:50-55.
[41]王伟.不同组织类型脑转移瘤MRI征象分析及SWI对其诊断的临床应用[D].大连医科大学,影像医学与核医学,2012,硕士.
[42]邓康胜.EcoTILLING技术体系的建立及其在棉花优异复等位基因发掘中的初探[D].南京农业大学,作物遗传育种,2012,硕士.
[43]熊丽.二十世纪六、七十年代图案造型的应用研究[D].湖北工业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[44]温继伟.油页岩钻孔水力开采用射流装置的数值模拟与实验研究[D].吉林大学,2014.
[45]赵秀梅.亚洲玉米螟绿色防控技术田间防效测定与评价[D].中国农业科学院,植物保护（专业学位）,2012,硕士.
[46]吴文正.慢病毒介导的人SLC2A9基因过表达对人近曲小管上皮细胞尿酸转运功能的影响[D].广州医科大学,外科学,2014,硕士.
[47]代方方.经导管介入治疗儿童室间隔缺损与开胸修补术及镶嵌治疗的对比研究[D].山东大学,儿科学（专业学位）,2013,硕士.
[48]都蔚.新形势下加强党的思想政治工作能力建设研究[D].中共陕西省委党校,思想政治教育,2014,硕士.
[49]卢琼.脑缺血药物筛选细胞模型的构建及应用研究[D].西南交通大学,微生物与生化药学,2014,硕士.
[50]侯增广,吴沧浦.一种基于动态规划策略的离散动态大系统递阶优化神经网络[J].自动化学报,1999,01:48-54.