禽流感病毒RT-LAMP系列检测方法的建立和应用

【摘要】A型流感病毒属于正粘病毒科,病毒基因组共有8个片段,至少编码11种蛋白。病毒粒子表面囊膜上有血凝素(hemagglutinin,HA)与神经氨酸酶(neuraminidase,NA)两种表面纤突。根据HA与NA的不同可区分为不同的亚型,H有H1-H16,而N有N1～N10。禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)血清亚型众多,抗原变异性强,宿主范围广泛,亚型之间无交叉保护性。在禽流感的HA亚型中,只有H5和H7亚型对禽是高致病性的,称为高致病性禽流感(Highpathogenicavianinfluenza,HPAI)。近年在全球时见报道的主要是H5N1和H7N1亚型以及去年报道的H7N9亚型AIV。比如1997年香港H5N1亚型AIV直接感染人并致死；1999-2000年在意大利爆发的H7N1病毒导致1300多万羽鸡死亡,造成重大经济损失；2003年荷兰爆发了H7N7亚型禽流感,不仅导致了重大的经济损失,而且感染89人。去年爆发的H7N9亚型AIV,造成超过300余人感染,50多人死亡。这些事件提示高致病性禽流感不仅会给养禽业造成巨大经济损失,同时还可以跨越宿主屏障直接感染人,严重威胁公共卫生安全。因此,AIV的早期快速诊断和及时监测,对保障全球养禽业的发展和人类健康至关重要。目前,灵敏、特异的分子生物学检测技术,如荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)等方法已经在禽流感的病毒检测中发挥着重要作用,但这些方法都需要复杂的仪器设备(如PCR仪、荧光显微镜等)和具有一定操作技能的实验室人员,在一些基层的实验室使用时受到限制。如何能够针对最先接触疫情的基层实验室,不需要昂贵的仪器就能在现地养殖场进行快速、准确的检测,是迫切需要解决的实际问题。恒温条件下即能进行反应的环介导恒等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)检测技术应运而生。与传统的PCR和荧光定量PCR相比,LAMP不需要昂贵的仪器设备,具有简便、快速、灵敏、特异的特点,尤其适合在基层和现地开展病原微生物的早期诊断和筛查。本研究的目的是通过设计针对特异识别AIV的M、HA、NA基因序列中6个不同区段的LAMP引物,建立一系列能够快速便捷地检测A型禽流感病毒的有效方法。主要包括以下研究内容：1、A型通用型AIVRT-LAMP检测方法的建立根据GenBank中登录的A型禽流感病毒(AIV)(A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1))的基质蛋白M基因序列,设计了一套特异识别M基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立了一种基于RT-LAMP技术的A型禽流感病毒诊断方法。结果显示,该方法能检测不同亚型的AIVs,且扩增反应可在30min内完成,对各型AIVs的最小检测限为0.01PFU的病毒含量,敏感性是常规RT-PCR方法的100倍。若在反应体系中添加FluorescentDetectionReagent(核黄绿素)染料后,可通过肉眼观察有无特异的绿色荧光来直接判定结果。该方法仅需一个恒温水浴锅就可完成扩增反应,非常适合现地及临床AIV病原的诊断和疫情监测。2、H9亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立根据H9亚型禽流感病毒(A/Chicken/HuNan/33/2008(H9N2))血凝素基因序列,设计了一套特异识别HA基因序列的LAMP引物,并以此套引物建立了检测H9亚型禽流感病毒的RT-LAMP诊断方法。结果显示,该方法能特异的检测H9亚型AIV,全部反应可在30min内完成,对H9亚型AIV的最小检测限为0.01PFU的病毒含量,灵敏度高于普通一步法RT-PCR100倍；对近年来分离到的6株H9N2亚型AIV的检测,该方法能对其进行良好的检测；通过对人工感染棉拭子样品的检测,发现RT-LAMP和病毒分离方法可从第1d即可检测到病毒,而常规RT-PCR方法到第3d才能检测到病毒,进一步证明H9亚型AIVRT-LAMP方法的敏感性好,利于H9亚型AIV的早期诊断。3、H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立根据H5亚型禽流感病毒(A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1))血凝素基因序列,设计了一套特异识别H5亚型AIVHA基因的LAMP引物,并以此套引物建立了用于检测H5亚型禽流感病毒的RT-LAMP诊断方法。结果显示,方法能特异的检测H5亚型AIV,与其他亚型流感病毒及常见禽病病原无非特异性反应,该方法对H5亚型AIV的最小检测限为0.1PFU的病毒含量,灵敏度高于普通一步法RT-PCR10倍,全部反应可在30min内完成。通过对不同宿主来源的H5亚型AIV分离株的检测表明,该方法能够特异性地检测禽源、鸭源和猪源的H5亚型AIV。4、H7N9亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立根据H7亚型禽流感病毒(A/Chicken/HeB/2/2002(H7N2))血凝素基因序列,设计了一套特异识别H7亚型AIVHA基因序列的LAMP引物,并以此套引物建立了检测H7亚型禽流感病毒的RT-LAMP诊断方法。结果显示,该方法能特异的检测H7亚型AIV,与其他亚型流感病毒无非特异性反应。通过对H7亚型AIV不同致病力毒株的检测表明,该方法对LPAIV的H7亚型AIV的最小检测限为0.01PFU的病毒含量；对HPAIV的H7亚型AIV的最小检测限为0.1PFU的病毒含量；对不同来源的H7N9病毒的最低检测限为0.01PFU的病毒含量。这些结果表明,该方法可特异性地检测低致病性和高致病性H7亚型AIV以及新出现的H7N9流感病毒。此外,通过人工感染实验样品检测表明,RT-LAMP方法和病毒分离都能够在病毒感染后第1d检测到排毒,而一步法RT-PCR需要在感染后3d才能检测到排毒,进一步证明该方法的灵敏度高。针对H7N9流感病毒(A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9))NA基因序列,设计了1套特异识别NA基因序列的RT-LAMP引物,并以此套引物建立了检测N9亚型AIV的RT-LAMP诊断方法。该方法的最小检测限为0.01PFU的病毒含量,灵敏度高于普通一步法RT-PCR100倍。从上海和安徽省的活禽市场、养殖场和野鸟栖息地采集了大量的临床样品(包括饮水、土壤、泄殖腔拭子、喉拭子样品),检测结果表明,H7N9RT-LAMP方法可在30min内完成样品检测,而且能够有效的从不同来源样品中检测到H7N9流感病毒,进一步证明该方法的可靠性和实用性。LAMP方法不需要昂贵的特殊仪器设备,反应结果可用肉眼直接观察,非常适合在基层开展病原微生物的早期诊断和筛查。本研究建立的AIV系列RT-LAMP方法具有特异性好、灵敏度高、简便快速、实用的优点,不仅为禽流感病毒的诊断、监测、早期预警提供了技术保障,而且也为禽流感的有效防控提供技术支撑。
【作者】包红梅；
【导师】李一经；陈化兰；
【作者基本信息】东北农业大学，预防兽医，2014，博士
【关键词】禽流感病毒；RT-LAMP；M基因；HA基因；NA基因；亚型鉴别；快速诊断；

【参考文献】
[1]陈水钫.去甲斑蝥素—聚乙二醇—聚已内酯嵌段共聚物胶束的研制[D].南方医科大学,药剂学,2012,硕士.
[2]雷远庆.成都地区“小灵通”无线市话业务市场推广研究[D].电子科技大学,2003.
[3]杨宁尹涛吕廷杰.九七工程需要系统升级[N].人民邮电,2003-03-06003.
[4]任伟.从法国大革命到美国的乡镇自治[D].西南政法大学,法学理论,2012,硕士.
[5]汪坤,李巍,李莉莉.宽带无线接入——WiMAX[J].电信网技术.2005(03)
[6]周竹.民族地区政府能力建设研究[D].湖北民族学院,民族学,2014,硕士.
[7]黄卿中.Orlicz Minkowski问题及其相关极值问题[D].上海大学,基础数学,2014,博士.
[8]贾园,颜红侠,公超,冯逸晨.石墨烯的表面改性及其在摩擦领域中的应用[J].材料导报,2013,05:18-21.
[9]杨宛璐.基于性能势的改进平均奖赏强化学习算法研究[D].广东工业大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[10]朱涟.南京郊区城市化与农民市民化研究[D].四川农业大学,农村与区域发展（专业学位）,2012,硕士.
[11]王磊.计算机系统安全漏洞研究[D].西安电子科技大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[12]姜艳静.电子商务中的客户关系管理研究[D].武汉大学,2004.
[13]韩俪.社会语言学视角下80后和00后的人名对比研究[D].吉林大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[14]叶修怡,吴东明.数字卫星接收机及Eb/N0门限的测量[J].广播与电视技术.2001(06)
[15]张煜.面向集装箱码头的仿真技术和优化方法研究[D].武汉理工大学,2007.
[16]韩婧.军事院校中“文化导入”型英语教学研究[D].西南大学,教育学,2013,硕士.
[17]许可.基于多特征的图像轮廓检测算法研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[18]陈体伟,余小娜,刘洁琼,林琼.石墨烯和铁氰化镍复合物的制备及对多巴胺的电催化性能研究[J].分析试验室,2015,03:311-314.
[19]杨本南.闽台高科技产业竞争互补机制研究[D].中国农业大学,2005.
[20]侯永慧.唐代诗刻文献研究[D].广西师范大学,中国古典文献学,2014,硕士.
[21]王冠文.基于WCDMA的电视直播系统设计[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2012,硕士.
[22]李晓蔓.中华苏维埃第一次全国代表大会研究[D].郑州大学,中共党史,2013,硕士.
[23]姜艳艳.内科胸腔镜对不明原因胸腔积液的诊断价值[D].山东大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[24]陈小雨.一部伟大的爱国诗篇[D].中央音乐学院,钢琴表演,2012,硕士.
[25]谷丁云.基于Wi-Fi Direct的对等的移动社交网络软件平台设计与原型实现[D].南京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[26]吴永强.广西郁江实时洪水预报与调度系统研究[D].河海大学,水文学及水资源,2003,硕士.
[27]韩晨.新教师的教学技能训练方案与效果研究[D].华东师范大学,高等教育学,2013,硕士.
[28]蔡秀珊,高虹,刘洋.一类多输入非线性系统的同时H~∞镇定[J].自动化学报,2012,03:473-478.
[29]陶欢华.Webmail邮件服务系统的设计与实现[D].新疆农业大学,2004.
[30]缪学超.布朗执政时期英国教育政策研究（2007.06-2010.05）[D].湖南师范大学,比较教育学,2013,硕士.
[31]彭日辉,罗力更,梁东图,王文英,马燕文.裂化塔焊缝缺陷鉴别[J].焊接学报.1985(04)
[32]陈颖.非甾体类药物对人卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用研究[D].重庆医科大学,妇产科学,2004,硕士.
[33]刘恩益.基于GPU的不可压缩管流并行数值模拟关键技术研究[D].杭州电子科技大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[34]王苏苏.基于CNN和互信息的PET/CT图像配准方法的研究[D].青岛大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[35]高娜.日本的文化外交及其对中国的启示[D].河北师范大学,国际政治,2013,硕士.
[36]王瑞伟.信托法律制度在企业债务重组中的应用研究[D].中国政法大学,经济法学,2004,硕士.
[37]甘高凡.高层建筑风效应的数值模拟研究及等效静力风荷载计算[D].广州大学,2012.
[38]于坤.基于VRPSDP问题的城市冷链物流配送路径优化研究[D].大连海事大学,物流工程,2014,硕士.
[39]曲毅.新型脑保护类抗脑缺血药物合成及活性研究[D].佳木斯大学,药物化学,2012,硕士.
[40]金晓馨.香叶醇抗胰腺癌作用及其机制的实验研究[D].中南大学,临床医学,2013,博士.
[41]李龙.羊群行为与股市泡沫关系实证研究[D].南京财经大学,金融学,2013,硕士.
[42]骆英宏.开源软件著作权保护制度研究[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[43]余江波,王家序,田凡,王洋.水润滑塑料合金轴承的润滑机理[J].农业机械学报.2007(03)
[44]吴启峰.注塑模具零件分类体系及其参数化图库研究[D].大连理工大学,机械制造及其自动化,2004,硕士.
[45]刘东旭.俄白哈关税同盟对新疆外经贸的影响[D].新疆财经大学,国际贸易学,2013,硕士.
[46]周红.保密散列数字签名及其在信用卡安全中的应用[D].河北工业大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[47]华建敏.总结大变样的前三年规划大提高的新三年——为上海本世纪最后一轮三年大推进奠定基础[J].上海综合经济.1994(12)
[48]葛维燕.数据挖掘技术及其在数据集市中的应用[D].大连海事大学,2001.
[49]程海东.高管团队异质性、战略双元与组织绩效的关系研究[D].山东大学,企业管理,2013,硕士.
[50]王维江,张俊霞.数据可视化技术研究的新进展[J].计算机时代,2002,05:4-6.