Cep164基因在小鼠胚胎生长发育过程中的功能及作用

Cep164基因在小鼠胚胎生长发育过程中的功能及作用

作者:师大云端图书馆 时间:2015-08-18 分类:硕士论文 喜欢:4287
师大云端图书馆

【摘要】纤毛是一种以细胞微管为主形成的突出于细胞表面的毛发状结构,是一种非常保守细胞器官,原生生物到哺乳动物的细胞都观察到纤毛,纤毛哺乳动物体内大多数细胞广泛存在。近年来研究发现,很多人类疾病都与纤毛形成障碍相关,纤毛结构、长度的失调会导致疾病的发生,这种由于纤毛形成障碍导致的病变,统称为纤毛病变,目前报道的纤毛病变包括Joubert综合征,Meckel综合征,Bardet-Biedl综合征,肾消耗病和多囊肾综合征等。纤毛病变的患者常常出现多个症状,例如内脏转位,生殖能力降低,多指(趾),视觉、听觉、嗅觉的减退,脑发育异常等,肝肾的多囊性增生,呼吸系统感染,这些症状出现的比率不一并且搭配也不一致。研究发现纤毛除了提供流体推动力参与细胞的运动功能之外,还具有信号传导的功能,它参与调控细胞生理活动、增殖与分化以及动物个体发育。因此,深入地探索纤毛调控机理对基础生物学理论的发展和人类纤毛病变相关疾病的攻克有重要意义。基因敲除技术为纤毛调控机制及基因相关表型的研究提供了有力的技术支持。Cep164是中心体激活元件Cep家族一员,MoumitaChaki发现Cep164基因在纤毛相关肾消耗病患者中发生纯合子点突变。研究人员通过siRNA技术沉默细胞中Cep164基因证明Cep164基因与纤毛形成过程中囊泡在基体的定位有关,当Cep164基因突变时会导致细胞中纤毛缺失。Cep164作为DDR的调节因子,在DNA损伤和复制应激时,发生核聚集参与DNA修复过程。但是,Cep164基因对哺乳动物生长发育的影响以及Cep164基因突变表型至今无人报道,沉默小鼠胚胎Cep164基因,对确定Cep164基因在纤毛形成中的调控网络,Cep164基因与Shh信号的关系以及Cep164基因突变疾病的阐述与诊断具有重要意义。本研究将带有两个同源臂的打靶载体,与ES细胞Cep164locus重组,敲除第二外显子,沉默Cep164基因的ES细胞注射假孕小鼠,获得的“基因敲除”小鼠,与C57BL/6小鼠杂交后,通过基因型检测确定Cep164基因突变小鼠制备是否成功。Cep164基因突变杂合子小鼠相互杂交后,收集Cep164基因突变纯合子小鼠和胚胎,对照野生型,确定Cepl64基因的遗传表型。间接免疫荧光法检测Cep164基因对纤毛形成相关appendagesCP110,Ftm,Odf2,Cep290,Cep120,Ofdl和Ninein的影响,Westernblot检测胚胎CP110表达水平确定Cepl64基因对CP110影响,通过免疫共沉淀验证CP110与Cep164的关系。通过胚胎与Ptchl和Glil探针进行原位杂交,Westernblot检测胚胎Gli3蛋白质表达水平,Lacz染色以及间接免疫荧光法检测胚胎神经管特异转录因子Pax6.0来确定Cep164基因与Shh信号通路的关系。胚胎与Foxgl,Gbx2,Otx2,Fgf8和Enl探针原位杂交分析Cep164基因对脑发育影响。通过比较UV处理后Cep164基因突变细胞与野生型细胞γH2AX的核聚集程度,检测Cep164基因突变细胞与野生型细胞γH2AX的核聚集程度,以及Cep164基因突变胚胎与野生型胚胎YH2AX的核聚集程度,来确定Cepl64基因在胚胎和细胞DNA修复过程的作用。通过Tunel和Brdu法评价Cep164基因对胚胎发育过程细胞增殖与凋亡影响。外源转染过表达Cep164蛋白,通过检测UV处理后细胞γH2AX核聚集程度与CP110在母中心粒表达比例来评价外源Cep164基因对内源Cep164基因的影响。本研究利用同源重组方法成功获得Cep164基因突变嵌合体小鼠,Cep164基因突变纯合子小鼠死于出生前,胚胎仅能发育存活到E9.5day。Cep164基因突变小鼠胚胎表型为胚胎发育迟缓,心脏外膜增大扩张,血管发育不良,背侧神经管不对称发育,胚胎躯体异常弯曲,面部前脊神经管不闭合,头部神经管闭合不全,心脏反向扭转弯曲。Tunel和Brdu法检测胚胎E9.5day发育过程中细胞的增殖与凋亡,发现Cep164基因突变胚胎细胞增殖减少,细胞凋亡增多。以上结果说明Cep164基因是维持胚胎早期正常发育的重要基因,Cep164基因突变会导致小鼠胚胎早期死亡,出现纤毛病变表型,在胚胎发育过程中细胞增殖减少,凋亡增多导致胚胎出现发育迟缓表型。与野生型相比,Cep164基因敲除细胞中纤毛形成appendageFtm、Odf2、Cep290、Cep120、Ofd1和Ninein位置及表达量无明显变化,但CP110在母中心粒和子中心粒均表达的比例增多。同时,本研究发现Cep164基因突变胚胎中CP110蛋白表达量高于野生型胚胎。通过免疫共沉淀揭示Cep164蛋白与CP110蛋白无直接相互作用关系,根据CP110蛋白在细胞循环及纤毛生产过程中的表达及调节规律,推测Cep164通过间接方式调节定位在母中心粒上的CP110的降解过程。原位杂交结果显示,Cep164突变小鼠胚胎Ptchl和Glil表达消失,与Lacz染色显示Ptch表达消失结果一致。Cep164基因突变导致受Shh信号抑制的特异性转录因子Pax6.0表达向神经管腹侧扩张至整个神经管。Westernblotting结果显示,Cep164突变小鼠胚胎G1i3基因表达的Gli3FL蛋白增多,G1i3Rep蛋白减少,Gli3FL/Gli3Rep增高。以上结果说明Cep164基因影响Shh信号通路的活性,当Cep164基因突变导致胚胎Shh信号消失。与野生型相比,Cep164基因突变小鼠胚胎头部Gbx2,前中脑Otx2和中后脑的边界Fgf8表达无明显变化,但端脑泡Foxgl表达减少,前神经脊Fgf8表达减少,Otx2在晶状体板和嗅状体板表达减少,背侧中脑和后脑前Enl表达减少。以上结果说明,Cep164基因是维持胚胎头部正常发育重要基因,Cep164基因突变导致前脑发育异常,影响嗅觉和视觉功能。与野生型胚胎相比,Cep164突变小鼠胚胎中γH2AX的核聚集程度明确增加。通过UV处理人为损伤细胞DNA后,观察到Cep164基因突变细胞γH2AX的核聚集程度明确高于野生型细胞。以上结果证实Cep164基因参与胚胎发育过程中细胞DNA修复过程,Cep164基因突变导致小鼠胚胎DNA修复功能障碍,这可能是Cep164基因突变小鼠发育早期死死亡的原因之与3T3细胞相比,外源转染过表达Cep164基因的3T3细胞出现定位在母中心粒上的CP110表达比例增加现象。UV处理后,过表达Cep164基因的3T3细胞γH2AX的核聚集程度明显高于3T3细胞对照组,以上结果说明外源性Cep164基因会干扰内源性Cep164基因功能,导致细胞DNA修复功能降低和CP110蛋白降解障碍。
【作者】王春花;
【导师】张秀英;
【作者基本信息】东北农业大学,基础兽医学,2014,博士
【关键词】Cep164;纤毛;表型;Shh;脑发育;

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